eng
Выпуск #5/2023
А.И.Ахметова, И.В.Яминский, И.Ю.Ильина, Ю.Д.Александров, В.Е.Тихомирова, Е.В.Попова
АСМ-ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОПЛАТФОРМ ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯ
АСМ-ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОПЛАТФОРМ ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯ
Просмотры: 633
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255
В данной работе исследуются варианты наноплатформ для доставки биологически активных соединений, включая двуцепочечную РНК (дцРНК), в растительную клетку на основе кальций-фосфатных (CaP), хитозановых, золотых наночастиц, а также наноэмульсий на основе неионогенных ПАВ. С помощью атомно-силовой микроскопии оценивались морфологические характеристики носителей, характер расположения на подложках графита и слюды, геометрические размеры для дальнейшей оценки их возможности формировать комплексы с дцРНК. Проект нацелен на поиск наноплатформ различной химической природы для создания композитов с биологически активными РНК, которые обеспечивают сохранность молекул при экзогенном применении (опрыскивании растений) и увеличивают эффективность их доставки в листья растений для защиты растений от патогенов (вирусов).
В данной работе исследуются варианты наноплатформ для доставки биологически активных соединений, включая двуцепочечную РНК (дцРНК), в растительную клетку на основе кальций-фосфатных (CaP), хитозановых, золотых наночастиц, а также наноэмульсий на основе неионогенных ПАВ. С помощью атомно-силовой микроскопии оценивались морфологические характеристики носителей, характер расположения на подложках графита и слюды, геометрические размеры для дальнейшей оценки их возможности формировать комплексы с дцРНК. Проект нацелен на поиск наноплатформ различной химической природы для создания композитов с биологически активными РНК, которые обеспечивают сохранность молекул при экзогенном применении (опрыскивании растений) и увеличивают эффективность их доставки в листья растений для защиты растений от патогенов (вирусов).
АСМ-ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОПЛАТФОРМ ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5115-8030 / akhmetovaai@my.msu.ru
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф. МГУ имени М. В.Ломоносова, ORCID: 0000-0001-8731-3947
И.Ю.Ильина1, инж., ORCID: 0000-0003-0967-6296
Ю.Д.Александров1, 3, инж., ORCID: 0009-0000-4017-7124
В.Е.Тихомирова1, 3, к.х.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0003-4368-3430
Е.В.Попова1, 3, к.х.н., вед. инж., ORCID: 0000-0002-2419-2823
Аннотация. В данной работе исследуются варианты наноплатформ для доставки биологически активных соединений, включая двуцепочечную РНК (дцРНК), в растительную клетку на основе кальций-фосфатных (CaP), хитозановых, золотых наночастиц, а также наноэмульсий на основе неионогенных ПАВ. С помощью атомно-силовой микроскопии оценивались морфологические характеристики носителей, характер расположения на подложках графита и слюды, геометрические размеры для дальнейшей оценки их возможности формировать комплексы с дцРНК. Проект нацелен на поиск наноплатформ различной химической природы для создания композитов с биологически активными РНК, которые обеспечивают сохранность молекул при экзогенном применении (опрыскивании растений) и увеличивают эффективность их доставки в листья растений для защиты растений от патогенов (вирусов).
Ключевые слова: наноплатформы, золотые наночастицы, кальций-фосфатные частицы, наноэмульсии, сканирующая зондовая микроскопия, бионаноскопия
Для цитирования: А.И. Ахметова, И.В. Яминский, И.Ю. Ильина, Ю.Д. Александров, В.Е. Тихомирова, Е.В. Попова. АСМ-исследование наноплатформ для доставки биологически активных соединений в растения. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. Т. 16, № 5. С. 248–255. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255
Received: 8.08.2023 | Accepted: 18.08.2023 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255
Original paper
AFM STUDY OF NANOPLATFORMS FOR THE BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS DELIVERY TO PLANTS
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-5115-8030 / akhmetovaai@my.msu.ru
I.V.Yaminsky2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., ORCID: 0000-0001-8731-3947
I.Yu.Ilyina1, Engineer, ORCID: 0000-0003-0967-6296
Yu.D.Aleksandrov1 ,3, Engineer, ORCID: 0009-0000-4017-7124
V.E.Tikhomirova1 ,3, Researcher, ORCID: 0000-0003-4368-3430
E.V.Popova1 ,3, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2419-2823
Abstract. In this work, nanoplatforms based on calcium phosphate (CaP), chitosan, and gold nanoparticles, as well as nanoemulsions based on nonionic surfactants, are studied for the delivery of biologically active compounds, including double-stranded RNA (dsRNA), into a plant cell. Using atomic force microscopy, the morphological characteristics of the carriers, the nature of the arrangement on graphite and mica substrates, and the geometric dimensions were evaluated to further assess their ability to form complexes with dsRNA. The project is aimed at searching for nanoplatforms of various chemical nature to create composites with biologically active RNA, which ensure the safety of molecules during exogenous application (plant spraying) and increase the efficiency of their delivery to plant leaves to protect plants from pathogens (viruses).
Keywords: nanoplatforms, gold nanoparticles, calcium phosphate particles, nanoemulsions, scanning probe microscopy, bionanoscopy
For citation: A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky, I.Yu. Ilyina, Yu.D. Aleksandrov, V.E. Tikhomirova, E.V. Popova. AFM study of nanoplatforms for the biologically active compounds delivery to plants. NANOINDUSTRY. 2023. V. 16, no. 5. PP. 248–255. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255.
ВВЕДЕНИЕ
В связи с изменениями климата вспышки болезней сельскохозяйственных растений и экологические стрессы, вероятно, будут оказывать возрастающее негативное воздействие на производство продуктов питания. Эта проблема требует разработки новых инновационных методов защиты растений от патогенов, основанных на достижениях молекулярной, клеточной биологии и биотехнологии. Такими методами являются РНК-технологии, основанные на механизме РНК-интерференции (РНКи), который является основным механизмом защиты растений от вирусных инфекций. При вирусных инфекциях этот механизм индуцируется дцРНК (репликативной формой вирусной РНК) и приводит к деградации комплементарной вирусной РНК [1].
Наиболее перспективным и безопасным (экологически чистым) представляется подход, при котором антивирусная защита на основе РНКи индуцируется опрыскиванием растений экзогенной дцРНК (или шпилечной РНК), комплементарной вирусной РНК, названный "спрей-индуцированный сайленсинг генов" (spray-induced gene silencing (SIGS)) [2]. Опрыскивание растений дцРНК успешно применяется для индукции устойчивости к вирусам на различных сельскохозяйственных культурах. Одной из проблем при применении молекул дцРНК является их нестабильность в окружающей среде, что приводит к короткому временному промежутку их антивирусной активности. Другая основная проблема заключается в обеспечении эффективной доставки молекул РНК в клетки растения. Специфическая структура поверхности листа и собственно растительной клетки делают проблему доставки биологически активных молекул в растение особенно сложной. Для решения этих задач используются разнообразные наноплатформы [3]. Однако разработка биосовместимых, биодеградируемых наноплатформ, обеспечивающих защиту регуляторных РНК и их эффективное проникновение в клетки растений, по-прежнему является актуальной задачей, без решения которой широкое применение РНК технологий в практике растениеводства невозможно.
Размер наноплатформ является существенным фактором, ограничивающим проникновение средств доставки в растения [4]. Йонг и др. (2021) пришли к выводу, что размер в 50 нм является базовой величиной для наноматериалов, которые могут свободно проникать в клетки пыльцы томатов [5]. Другие исследования показали, что размер наночастиц, которые могут свободно проникать в растительные клетки, должен быть менее 20 нм, по крайней мере, в одном измерении. На проникновение композитов в растительные клетки влияют и такие характеристики наноматериалов, как например, форма и дзета-потенциал. Поэтому для выбора платформы, выступающей в качестве носителя для стабилизации, защиты и доставки молекул дцРНК в клетки растений, требуется тщательное исследование их морфологических, геометрических, адсорбционных и других физических характеристик.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
CaP-частицы: CaP-частицы размером 80±20 нм и CaP-частицы, покрытые хитозаном 5 кДа размером 160±25 нм, были синтезированы по методике [6]. Образец суспензии частиц объемом 1 мкл наносили на графит, выдерживали 5 мин, промокали бумагой. Хитозановые частицы из 5 кДа хитозана размером 110±20 нм, хитозановые частицы из 72 кДа гликоль-хитозана размером 250±10 нм были получены методом ионотропного гелеобразования [7]. Данные о размерах получены методом динамического светорассеяния.
Золотые наночастицы: в работе рассматривались золотые наночастицы в полиэтиленимине, концентрация – 0,2 ммол, 0,5 мкл наносили на слюду и на графит.
Наноэмульсии на основе неионогенных ПАВ: ниосомы с хлоргексидином, эмульсии с частицами глины с модифицированной поверхностью, 0,5 мкл наносили на слюду и на графит.
Основной метод настоящего исследования – атомно-силовая микроскопия. Сканирование проводилось на воздухе в контактном режиме кантилевером CSG10 на подложках свежесколотых графита (высокоориентированный пиролитический графит) и слюды с помощью атомно-силового микроскопа "ФемтоСкан". Обработка результатов проводилась в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн", которое позволяет создавать трехмерные изображения, строить контурную длину, проводить фильтрацию, обработку изображений и выполнять необходимые количественные вычисления: площадь, объем, периметр, наибольшую высоту, шероховатость объекта [8, 9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В работе оценивались морфологические характеристики носителей, характер расположения на подложках графита и слюды, геометрические размеры для дальнейшей оценки возможности формировать комплексы с дцРНК (рис.1).
Для каждого образца был сформирован характерный профиль поверхности, чтобы в дальнейшем при создании комплекса для доставки дцРНК можно было идентифицировать носитель по характерным паттернам морфологии поверхности.
CаP-ЧАСТИЦЫ, ГИБРИДНЫЕ ЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ФОСФАТА КАЛЬЦИЯ И ХИТОЗАНА
Поскольку фосфат кальция входит в состав человеческого организма, он является перспективным материалом для использования в медицине. Благодаря биосовместимости, биодеградируемости, контролируемым свойствам фосфат кальция может применяться в виде нано- и микрочастиц в качестве носителя лекарственных средств [10].
CaP-частицы являются хорошим кандидатом на роль носителя, поскольку обладают высоким сродством к нуклеиновым кислотам [11], а благодаря контролируемому синтезу возможно получить частицы подходящего размера для доставки генов внутрь клеток. В работе рассматривались: CaP-частицы (рис.2), а также гибридные частицы, представляющие собой CaP-частицы, покрытые 5 кДа хитозаном (рис.3). Мы предполагаем, что такие гибридные частицы могут объединить перспективные свойства двух материалов.
ХИТОЗАНОВЫЕ ЧАСТИЦЫ
Носители на основе хитозана являются крайне перспективными из-за его доказанной биосовместимости, биоразлагаемости, нетоксичности и способности к адсорбции. Наночастицы из хитозана и его производных могут применяться для доставки нуклеиновых кислот [12, 13], положительный заряд поверхности таких частиц способен обеспечить эффективную загрузку и защиту включенных препаратов от нуклеазной активности [14]. Однако несмотря на большой прогресс в использовании хитозана в области медицины и фармацевтики, применение систем доставки на основе хитозана в сельском хозяйстве пока ограничено [15].
В нашем исследовании мы изучили частицы, полученные из лактата хитозана со средним молекулярным весом 5 кДа (рис.4) и частицы из производного 72 кДа гликоль-хитозана (рис.5).
ЗОЛОТЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ
Золотые наночастицы обладают минимальной цитотоксичностью [16]. Однако об использовании этого вектора в растительных клетках сообщается относительно редко. Чжан и др. использовали различные размеры и формы золотых наночастиц для введения ДНК-Cy3 в растительные клетки путем инъекции, сферические частицы размером 10 нм, функционализированные малые интерферирующие РНК, оказались наиболее эффективными при доставке миРНК и вызывали сайленсинг генов в зрелых листьях растений Nicotiana benthamiana [17].
В образце на слюде присутствуют как маленькие частицы около 100 нм, так и более крупные – около 400 нм, характерный диапазон высот – от 8 до 30 нм (рис.6). Золотые наночастицы на графите агрегировали.
НАНОЭМУЛЬСИИ НА ОСНОВЕ НЕИОНОГЕННЫХ ПАВ
Водный раствор полиэтиленгликоля изменяет проницаемость клеточной мембраны, что позволяет чужеродным генам легко проникать в ядро [18]. Этот метод относительно прост в применении на многих видах растений. По итогам измерений все исследуемые образцы ПАВ легли на поверхности графита пленкой без характерных частиц, на образце с глиной обнаружены частицы (рис.7). Образец с хлоргексидином образует ниосомы, но при высыхании на воздухе они разрушаются.
ВЫВОДЫ
Разрабатываемые РНК-технологии, основанные на достижениях молекулярной, клеточной биологии и биотехнологии, являются новыми инновационными методами защиты растений от патогенов (в частности, вирусов). Разработка эффективных композитов для экзогенной обработки сельскохозяйственных культур является актуальной задачей. В данной работе были получены 3D-изображения носителей на основе кальций-фосфатных, хитозановых, золотых наночастиц, а также наноэмульсий на основе неионогенных ПАВ. Оценены такие параметры, как характер адсорбции на гидрофобной поверхности графита, склонность к агрегации, характер распределения по поверхности, геометрические размеры частиц.
Сканирующая зондовая микроскопия может использоваться в качестве инструмента для трехмерной визуализации с точностью до единиц нанометров и для измерения локальных механических и физико-химических свойств наноплатформ при конструировании композитов с биологически активными молекулами (различными регуляторными РНК и пептидами).
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа А.И.Ахметовой, И.Ю.Ильиной, Ю.Д.Александрова, В.Е.Тихомировой, Е.В.Поповой поддержана РНФ (проект № 23-74-30003).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yang Z., Li Y. Dissection of RNAi-Based Antiviral Immunity in Plants. Curr. Opin. Virol. 2018, 32, 88–99. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2018.08.003
Dubrovina A.S.; Kiselev K.V. Exogenous RNAs for Gene Regulation and Plant Resistance. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2282. https://doi.org/10.3390/ijms20092282
Li P., Huang Y., Fu C., Jiang S.X., Peng W., Jia Y., Peng H., Zhang P., Manzie N., Mitter N., Xu Z.P. Eco-friendly biomolecule-nanomaterial hybrids as next-generation agrochemicals for topical delivery. EcoMat, 2021, 3, Article e12132. https://doi.org/10.1002/eom2.12132
Zhi H., Chen H. et al. Layered Double Hydroxide Nanosheets Improve the Adhesion of Fungicides to Leaves and the Antifungal Performance. ACS Appl. Nano Mater. 2022. Vol. 5. PP. 5316–5325.
Yong J., Zhang R., Bi S. et al. Sheet-like clay nanoparticles deliver RNA into developing pollen to efficiently silence a target gene. Plant Physiol. 2021. Vol. 2. PP. 886–899.
Popova E.V., Tikhomirova V.E., Beznos O.V., Chesnokova N.B., Grigoriev Y.V., Klyachko N.L., Kost O.A. Chitosan-covered calcium phosphate particles as a drug vehicle fordelivery to the eye. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2022. Vol. 40. P. 102493. https://doi.org/10.1016/j.nano.2021.102493
Popova E.V., Tikhomirova V.E., Beznos O.V., Grigoriev Y.V., Chesnokova N.B., Kost O.A. Chitosan nanoparticles – a drug delivery system in the anterior part of the eye. Bulletin of Moscow University. Series 2: Chemistry, 2023, Vol. 64 (2), PP. 141–151. https://doi.org/10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-2-141-151
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14, no. 1 (103). PP. 62–67. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. FemtoScan Online software platform for biomedical applications and materials science. Medicine and High Technologies. 2018. Vol. 2. PP. 10–13.
Popova E.V., Matveeva O.D., Beznos O.V., Tikhomirova V.E., Kudryashova Y., Grigoriev Y.V., Chesnokova N.B., Kost O.A. Chitosan-covered calcium phosphate particles co-loaded with superoxide dismutase 1 and ace inhibitor: Development, characterization and effect on intraocular pressure. Pharmaceutics. 2023. Vol. 15, no. 2. P. 550. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15020550
Neuhaus B., Frede A., Westendorf A.M., Epple M. Gene silencing of the pro-inflammatory cytokine TNF-α with siRNA delivered by calcium phosphate nanoparticles, quantified by different methods. J. Mater. Chem. B. 2015. Vol. 3. PP. 4186–7193. https://doi.org/10.1039/C5TB01377A
Kolge H., Kadam K., Ghormade V. Chitosan nanocarriers mediated dsRNA delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pesticide Biochemistry and Physiology. 2023. Vol. 189. P. 1055292. https://doi.org/10.1016/j.pestbp. 2022.105292
Chuan D., Jin T., Fan R., Zhou L., Guo G. Chitosan for gene delivery: Methods for improvement and applications. Adv Colloid Interface Sci. 2019. Vol. 268. PP. 25–38. https://doi.org/10.1016/j.cis.2019.03.007
Yan S., Ren B., Zeng B., Shen J. Improving RNAi efficiency for pest control in crop species. Biotechniques. 2020, 68 (5), 283–290. https://doi.org/10.2144/btn-2019- 0171
Kashyap P.L., Xiang X., Heiden P. Chitosan nanoparticle based delivery systems for sustainable agriculture. International Journal of Biological Macromolecules. 2015. Vol. 77. PP. 36–51. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac. 2015.02.039
Peng L.H., Huang Y.F., Zhang C.Z. et al. Integration of antimicrobial peptides with gold nanoparticles as unique non-viral vectors for gene delivery to mesenchymal stem cells with antibacterial activity. Biomaterials. 2016, 103, 137–149. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.06.057
Zhang H., Goh N.S., Wang J.W., Pinals R.L., González-Grandío E., Demirer G.S., Butrus S., Fakra S.C., Del Rio Flores A. et al. Nanoparticle cellular internalization is not required for RNA delivery to mature plant leaves. Nat. Nanotechnol. 2022. Vol. 17. PP. 197–205. https://doi.org/10.1038/s41565-021-01018-8
Yoo S.D., Cho Y.H., Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2007, 2, 1565–1572. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.199
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5115-8030 / akhmetovaai@my.msu.ru
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф. МГУ имени М. В.Ломоносова, ORCID: 0000-0001-8731-3947
И.Ю.Ильина1, инж., ORCID: 0000-0003-0967-6296
Ю.Д.Александров1, 3, инж., ORCID: 0009-0000-4017-7124
В.Е.Тихомирова1, 3, к.х.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0003-4368-3430
Е.В.Попова1, 3, к.х.н., вед. инж., ORCID: 0000-0002-2419-2823
Аннотация. В данной работе исследуются варианты наноплатформ для доставки биологически активных соединений, включая двуцепочечную РНК (дцРНК), в растительную клетку на основе кальций-фосфатных (CaP), хитозановых, золотых наночастиц, а также наноэмульсий на основе неионогенных ПАВ. С помощью атомно-силовой микроскопии оценивались морфологические характеристики носителей, характер расположения на подложках графита и слюды, геометрические размеры для дальнейшей оценки их возможности формировать комплексы с дцРНК. Проект нацелен на поиск наноплатформ различной химической природы для создания композитов с биологически активными РНК, которые обеспечивают сохранность молекул при экзогенном применении (опрыскивании растений) и увеличивают эффективность их доставки в листья растений для защиты растений от патогенов (вирусов).
Ключевые слова: наноплатформы, золотые наночастицы, кальций-фосфатные частицы, наноэмульсии, сканирующая зондовая микроскопия, бионаноскопия
Для цитирования: А.И. Ахметова, И.В. Яминский, И.Ю. Ильина, Ю.Д. Александров, В.Е. Тихомирова, Е.В. Попова. АСМ-исследование наноплатформ для доставки биологически активных соединений в растения. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. Т. 16, № 5. С. 248–255. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255
Received: 8.08.2023 | Accepted: 18.08.2023 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255
Original paper
AFM STUDY OF NANOPLATFORMS FOR THE BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS DELIVERY TO PLANTS
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-5115-8030 / akhmetovaai@my.msu.ru
I.V.Yaminsky2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., ORCID: 0000-0001-8731-3947
I.Yu.Ilyina1, Engineer, ORCID: 0000-0003-0967-6296
Yu.D.Aleksandrov1 ,3, Engineer, ORCID: 0009-0000-4017-7124
V.E.Tikhomirova1 ,3, Researcher, ORCID: 0000-0003-4368-3430
E.V.Popova1 ,3, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2419-2823
Abstract. In this work, nanoplatforms based on calcium phosphate (CaP), chitosan, and gold nanoparticles, as well as nanoemulsions based on nonionic surfactants, are studied for the delivery of biologically active compounds, including double-stranded RNA (dsRNA), into a plant cell. Using atomic force microscopy, the morphological characteristics of the carriers, the nature of the arrangement on graphite and mica substrates, and the geometric dimensions were evaluated to further assess their ability to form complexes with dsRNA. The project is aimed at searching for nanoplatforms of various chemical nature to create composites with biologically active RNA, which ensure the safety of molecules during exogenous application (plant spraying) and increase the efficiency of their delivery to plant leaves to protect plants from pathogens (viruses).
Keywords: nanoplatforms, gold nanoparticles, calcium phosphate particles, nanoemulsions, scanning probe microscopy, bionanoscopy
For citation: A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky, I.Yu. Ilyina, Yu.D. Aleksandrov, V.E. Tikhomirova, E.V. Popova. AFM study of nanoplatforms for the biologically active compounds delivery to plants. NANOINDUSTRY. 2023. V. 16, no. 5. PP. 248–255. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.5.248.255.
ВВЕДЕНИЕ
В связи с изменениями климата вспышки болезней сельскохозяйственных растений и экологические стрессы, вероятно, будут оказывать возрастающее негативное воздействие на производство продуктов питания. Эта проблема требует разработки новых инновационных методов защиты растений от патогенов, основанных на достижениях молекулярной, клеточной биологии и биотехнологии. Такими методами являются РНК-технологии, основанные на механизме РНК-интерференции (РНКи), который является основным механизмом защиты растений от вирусных инфекций. При вирусных инфекциях этот механизм индуцируется дцРНК (репликативной формой вирусной РНК) и приводит к деградации комплементарной вирусной РНК [1].
Наиболее перспективным и безопасным (экологически чистым) представляется подход, при котором антивирусная защита на основе РНКи индуцируется опрыскиванием растений экзогенной дцРНК (или шпилечной РНК), комплементарной вирусной РНК, названный "спрей-индуцированный сайленсинг генов" (spray-induced gene silencing (SIGS)) [2]. Опрыскивание растений дцРНК успешно применяется для индукции устойчивости к вирусам на различных сельскохозяйственных культурах. Одной из проблем при применении молекул дцРНК является их нестабильность в окружающей среде, что приводит к короткому временному промежутку их антивирусной активности. Другая основная проблема заключается в обеспечении эффективной доставки молекул РНК в клетки растения. Специфическая структура поверхности листа и собственно растительной клетки делают проблему доставки биологически активных молекул в растение особенно сложной. Для решения этих задач используются разнообразные наноплатформы [3]. Однако разработка биосовместимых, биодеградируемых наноплатформ, обеспечивающих защиту регуляторных РНК и их эффективное проникновение в клетки растений, по-прежнему является актуальной задачей, без решения которой широкое применение РНК технологий в практике растениеводства невозможно.
Размер наноплатформ является существенным фактором, ограничивающим проникновение средств доставки в растения [4]. Йонг и др. (2021) пришли к выводу, что размер в 50 нм является базовой величиной для наноматериалов, которые могут свободно проникать в клетки пыльцы томатов [5]. Другие исследования показали, что размер наночастиц, которые могут свободно проникать в растительные клетки, должен быть менее 20 нм, по крайней мере, в одном измерении. На проникновение композитов в растительные клетки влияют и такие характеристики наноматериалов, как например, форма и дзета-потенциал. Поэтому для выбора платформы, выступающей в качестве носителя для стабилизации, защиты и доставки молекул дцРНК в клетки растений, требуется тщательное исследование их морфологических, геометрических, адсорбционных и других физических характеристик.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
CaP-частицы: CaP-частицы размером 80±20 нм и CaP-частицы, покрытые хитозаном 5 кДа размером 160±25 нм, были синтезированы по методике [6]. Образец суспензии частиц объемом 1 мкл наносили на графит, выдерживали 5 мин, промокали бумагой. Хитозановые частицы из 5 кДа хитозана размером 110±20 нм, хитозановые частицы из 72 кДа гликоль-хитозана размером 250±10 нм были получены методом ионотропного гелеобразования [7]. Данные о размерах получены методом динамического светорассеяния.
Золотые наночастицы: в работе рассматривались золотые наночастицы в полиэтиленимине, концентрация – 0,2 ммол, 0,5 мкл наносили на слюду и на графит.
Наноэмульсии на основе неионогенных ПАВ: ниосомы с хлоргексидином, эмульсии с частицами глины с модифицированной поверхностью, 0,5 мкл наносили на слюду и на графит.
Основной метод настоящего исследования – атомно-силовая микроскопия. Сканирование проводилось на воздухе в контактном режиме кантилевером CSG10 на подложках свежесколотых графита (высокоориентированный пиролитический графит) и слюды с помощью атомно-силового микроскопа "ФемтоСкан". Обработка результатов проводилась в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн", которое позволяет создавать трехмерные изображения, строить контурную длину, проводить фильтрацию, обработку изображений и выполнять необходимые количественные вычисления: площадь, объем, периметр, наибольшую высоту, шероховатость объекта [8, 9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В работе оценивались морфологические характеристики носителей, характер расположения на подложках графита и слюды, геометрические размеры для дальнейшей оценки возможности формировать комплексы с дцРНК (рис.1).
Для каждого образца был сформирован характерный профиль поверхности, чтобы в дальнейшем при создании комплекса для доставки дцРНК можно было идентифицировать носитель по характерным паттернам морфологии поверхности.
CаP-ЧАСТИЦЫ, ГИБРИДНЫЕ ЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ФОСФАТА КАЛЬЦИЯ И ХИТОЗАНА
Поскольку фосфат кальция входит в состав человеческого организма, он является перспективным материалом для использования в медицине. Благодаря биосовместимости, биодеградируемости, контролируемым свойствам фосфат кальция может применяться в виде нано- и микрочастиц в качестве носителя лекарственных средств [10].
CaP-частицы являются хорошим кандидатом на роль носителя, поскольку обладают высоким сродством к нуклеиновым кислотам [11], а благодаря контролируемому синтезу возможно получить частицы подходящего размера для доставки генов внутрь клеток. В работе рассматривались: CaP-частицы (рис.2), а также гибридные частицы, представляющие собой CaP-частицы, покрытые 5 кДа хитозаном (рис.3). Мы предполагаем, что такие гибридные частицы могут объединить перспективные свойства двух материалов.
ХИТОЗАНОВЫЕ ЧАСТИЦЫ
Носители на основе хитозана являются крайне перспективными из-за его доказанной биосовместимости, биоразлагаемости, нетоксичности и способности к адсорбции. Наночастицы из хитозана и его производных могут применяться для доставки нуклеиновых кислот [12, 13], положительный заряд поверхности таких частиц способен обеспечить эффективную загрузку и защиту включенных препаратов от нуклеазной активности [14]. Однако несмотря на большой прогресс в использовании хитозана в области медицины и фармацевтики, применение систем доставки на основе хитозана в сельском хозяйстве пока ограничено [15].
В нашем исследовании мы изучили частицы, полученные из лактата хитозана со средним молекулярным весом 5 кДа (рис.4) и частицы из производного 72 кДа гликоль-хитозана (рис.5).
ЗОЛОТЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ
Золотые наночастицы обладают минимальной цитотоксичностью [16]. Однако об использовании этого вектора в растительных клетках сообщается относительно редко. Чжан и др. использовали различные размеры и формы золотых наночастиц для введения ДНК-Cy3 в растительные клетки путем инъекции, сферические частицы размером 10 нм, функционализированные малые интерферирующие РНК, оказались наиболее эффективными при доставке миРНК и вызывали сайленсинг генов в зрелых листьях растений Nicotiana benthamiana [17].
В образце на слюде присутствуют как маленькие частицы около 100 нм, так и более крупные – около 400 нм, характерный диапазон высот – от 8 до 30 нм (рис.6). Золотые наночастицы на графите агрегировали.
НАНОЭМУЛЬСИИ НА ОСНОВЕ НЕИОНОГЕННЫХ ПАВ
Водный раствор полиэтиленгликоля изменяет проницаемость клеточной мембраны, что позволяет чужеродным генам легко проникать в ядро [18]. Этот метод относительно прост в применении на многих видах растений. По итогам измерений все исследуемые образцы ПАВ легли на поверхности графита пленкой без характерных частиц, на образце с глиной обнаружены частицы (рис.7). Образец с хлоргексидином образует ниосомы, но при высыхании на воздухе они разрушаются.
ВЫВОДЫ
Разрабатываемые РНК-технологии, основанные на достижениях молекулярной, клеточной биологии и биотехнологии, являются новыми инновационными методами защиты растений от патогенов (в частности, вирусов). Разработка эффективных композитов для экзогенной обработки сельскохозяйственных культур является актуальной задачей. В данной работе были получены 3D-изображения носителей на основе кальций-фосфатных, хитозановых, золотых наночастиц, а также наноэмульсий на основе неионогенных ПАВ. Оценены такие параметры, как характер адсорбции на гидрофобной поверхности графита, склонность к агрегации, характер распределения по поверхности, геометрические размеры частиц.
Сканирующая зондовая микроскопия может использоваться в качестве инструмента для трехмерной визуализации с точностью до единиц нанометров и для измерения локальных механических и физико-химических свойств наноплатформ при конструировании композитов с биологически активными молекулами (различными регуляторными РНК и пептидами).
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа А.И.Ахметовой, И.Ю.Ильиной, Ю.Д.Александрова, В.Е.Тихомировой, Е.В.Поповой поддержана РНФ (проект № 23-74-30003).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yang Z., Li Y. Dissection of RNAi-Based Antiviral Immunity in Plants. Curr. Opin. Virol. 2018, 32, 88–99. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2018.08.003
Dubrovina A.S.; Kiselev K.V. Exogenous RNAs for Gene Regulation and Plant Resistance. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2282. https://doi.org/10.3390/ijms20092282
Li P., Huang Y., Fu C., Jiang S.X., Peng W., Jia Y., Peng H., Zhang P., Manzie N., Mitter N., Xu Z.P. Eco-friendly biomolecule-nanomaterial hybrids as next-generation agrochemicals for topical delivery. EcoMat, 2021, 3, Article e12132. https://doi.org/10.1002/eom2.12132
Zhi H., Chen H. et al. Layered Double Hydroxide Nanosheets Improve the Adhesion of Fungicides to Leaves and the Antifungal Performance. ACS Appl. Nano Mater. 2022. Vol. 5. PP. 5316–5325.
Yong J., Zhang R., Bi S. et al. Sheet-like clay nanoparticles deliver RNA into developing pollen to efficiently silence a target gene. Plant Physiol. 2021. Vol. 2. PP. 886–899.
Popova E.V., Tikhomirova V.E., Beznos O.V., Chesnokova N.B., Grigoriev Y.V., Klyachko N.L., Kost O.A. Chitosan-covered calcium phosphate particles as a drug vehicle fordelivery to the eye. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2022. Vol. 40. P. 102493. https://doi.org/10.1016/j.nano.2021.102493
Popova E.V., Tikhomirova V.E., Beznos O.V., Grigoriev Y.V., Chesnokova N.B., Kost O.A. Chitosan nanoparticles – a drug delivery system in the anterior part of the eye. Bulletin of Moscow University. Series 2: Chemistry, 2023, Vol. 64 (2), PP. 141–151. https://doi.org/10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-2-141-151
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14, no. 1 (103). PP. 62–67. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. FemtoScan Online software platform for biomedical applications and materials science. Medicine and High Technologies. 2018. Vol. 2. PP. 10–13.
Popova E.V., Matveeva O.D., Beznos O.V., Tikhomirova V.E., Kudryashova Y., Grigoriev Y.V., Chesnokova N.B., Kost O.A. Chitosan-covered calcium phosphate particles co-loaded with superoxide dismutase 1 and ace inhibitor: Development, characterization and effect on intraocular pressure. Pharmaceutics. 2023. Vol. 15, no. 2. P. 550. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15020550
Neuhaus B., Frede A., Westendorf A.M., Epple M. Gene silencing of the pro-inflammatory cytokine TNF-α with siRNA delivered by calcium phosphate nanoparticles, quantified by different methods. J. Mater. Chem. B. 2015. Vol. 3. PP. 4186–7193. https://doi.org/10.1039/C5TB01377A
Kolge H., Kadam K., Ghormade V. Chitosan nanocarriers mediated dsRNA delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pesticide Biochemistry and Physiology. 2023. Vol. 189. P. 1055292. https://doi.org/10.1016/j.pestbp. 2022.105292
Chuan D., Jin T., Fan R., Zhou L., Guo G. Chitosan for gene delivery: Methods for improvement and applications. Adv Colloid Interface Sci. 2019. Vol. 268. PP. 25–38. https://doi.org/10.1016/j.cis.2019.03.007
Yan S., Ren B., Zeng B., Shen J. Improving RNAi efficiency for pest control in crop species. Biotechniques. 2020, 68 (5), 283–290. https://doi.org/10.2144/btn-2019- 0171
Kashyap P.L., Xiang X., Heiden P. Chitosan nanoparticle based delivery systems for sustainable agriculture. International Journal of Biological Macromolecules. 2015. Vol. 77. PP. 36–51. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac. 2015.02.039
Peng L.H., Huang Y.F., Zhang C.Z. et al. Integration of antimicrobial peptides with gold nanoparticles as unique non-viral vectors for gene delivery to mesenchymal stem cells with antibacterial activity. Biomaterials. 2016, 103, 137–149. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.06.057
Zhang H., Goh N.S., Wang J.W., Pinals R.L., González-Grandío E., Demirer G.S., Butrus S., Fakra S.C., Del Rio Flores A. et al. Nanoparticle cellular internalization is not required for RNA delivery to mature plant leaves. Nat. Nanotechnol. 2022. Vol. 17. PP. 197–205. https://doi.org/10.1038/s41565-021-01018-8
Yoo S.D., Cho Y.H., Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2007, 2, 1565–1572. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.199
Отзывы читателей
