eng
TS_pub
technospheramag
technospheramag
ТЕХНОСФЕРА_РИЦ
Выпуск #2/2024
Е.В.Дубровин, О.Н.Королева, Н.В.Кузьмина, В.Л.Друца
ИССЛЕДОВАНИЕ АГРЕГАТОВ БЕЛКА ЯДЕРНОГО ЭКСПОРТА ВИРУСА ГРИППА А С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
ИССЛЕДОВАНИЕ АГРЕГАТОВ БЕЛКА ЯДЕРНОГО ЭКСПОРТА ВИРУСА ГРИППА А С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Просмотры: 484
Белок ядерного экспорта (NEP) играет важную роль во внутриклеточных процессах при инфицировании клеток хозяина. В данной работе впервые с помощью атомно-силовой микроскопии выявлены и охарактеризованы агрегаты различной морфологии и размеров. Полученные результаты могут быть востребованы для разработки новых противовирусных препаратов и создания систем доставки лекарственных средств на основе NEP.
Теги: atomic force microscopy influenza a virus nuclear export protein protein aggregation агрегация белка атомно-силовая микроскопия белок ядерного экспорта вирус гриппа а
Получено: 15.11.2023 г. | Принято: 20.11.2023 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118
Научная статья
Исследование агрегатов белка ядерного экспорта вируса гриппа А с помощью атомно-силовой микроскопии
Е.В.Дубровин1, 2, д.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-8883-5966 / dubrovin@polly.phys.msu.ru
О.Н.Королева3, к.х.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0009-0001-2359-0723
Н.В.Кузьмина4, к.ф.-м.н., науч. сотр., ORCID: 0009-0003-3585-8066
В.Л.Друца5, к.х.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0009-0003-7780-9182
Аннотация. Белок ядерного экспорта (NEP) играет важную роль во внутриклеточных процессах при инфицировании клеток хозяина. В данной работе впервые с помощью атомно-силовой микроскопии выявлены и охарактеризованы агрегаты различной морфологии и размеров. Полученные результаты могут быть востребованы для разработки новых противовирусных препаратов и создания систем доставки лекарственных средств на основе NEP.
Ключевые слова: белок ядерного экспорта, вирус гриппа А, атомно-силовая микроскопия, агрегация белка
Для цитирования: Е.В. Дубровин, О.Н. Королева, Н.В. Кузьмина, В.Л. Друца. Исследование агрегатов белка ядерного экспорта вируса гриппа А с помощью атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 2. С. 114–118.
https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118
Received: 15.11.2023 | Accepted: 20.11.2023 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118
Original paper
STUDY OF INFLUENZA A VIRUS NUCLEAR EXPORT PROTEIN AGGREGATES USING ATOMIC FORCE MICROSCOPY
Е.V.Dubrovin1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-8883-5966 / dubrovin@polly.phys.msu.ru
О.N.Koroleva3, Cand. of Sci. (Chemistry), Senior Researcher, ORCID: 0009-0001-2359-0723
N.V.Kuzmina4, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Researcher, ORCID: 0009-0003-3585-8066
V.L.Drutsa5, Cand. of Sci. (Chemistry), Leading Researcher, ORCID: 0009-0003-7780-9182
Abstract. The nuclear export protein (NEP) plays an important role in intracellular processes during infection of host cells. In this paper, aggregates of various morphologies and sizes were identified and characterized for the first time using atomic force microscopy. The results obtained may be used for development of new antiviral drugs and developing of NEP-based drug delivery systems.
Keywords: Nuclear export protein, influenza A virus, atomic force microscopy, protein aggregation
For citation: Е.V. Dubrovin, О.N. Koroleva, N.V. Kuzmina, V.L. Drutsa. Study of influenza A virus nuclear export protein aggregates using atomic force microscopy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 2. PP. 114–118. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118.
ВВЕДЕНИЕ
Белок ядерного экспорта NEP играет важную роль в жизненном цикле вируса гриппа А, включающую экспорт вирусных рибонуклеопротеинов из ядра инфицированной клетки на клеточную мембрану, регуляцию накопления вирусной геномной РНК и участие в высвобождении почкующихся вирионов [1, 2]. Ранее с помощью динамического рассеяния света была выявлена высокая агрегационная способность рекомбинантного белка NEP в различных условиях [3]. Наблюдался гетерогенный набор агрегатов NEP, типичные значения гидродинамического радиуса которых варьировали от нескольких нанометров до ~2,5 мкм. Тем не менее, детального исследования морфологии агрегатов NEP не проводилось. Целью данной работы было визуализировать и охарактеризовать агрегаты NEP дикого типа, полученных из телец включения, с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ зарекомендовала себя как эффективный инструмент для анализа различных молекул белка и белковых агрегатов [4, 5].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Белок NEP, соответствующий по структуре природному белку (без дополнительных модулей), экспрессировали в бактериальных клетках E. coli ER1821, содержащих плазмиду Eptrt-NEP, в которой ген белка находится под контролем промотора и терминатора РНК-полимеразы фага Т7. После подращивания и разрушения клеток белок выделяли в виде телец включения, как описано в работе [6]. Последующую дополнительную очистку проводили хроматографически по методике работы [7]. Белок (концентрация 0,3–3 мкг/мкл) хранили в буфере, содержащем 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 7,5, при 4 °C.
5–10 мкл раствора белка, разбавленного в 10–100 раз деионизованной водой или буфером, содержащим 10 мМ NaCl (pH 7,0), наносили на свежесколотую слюду на 10 мин, после чего промывали деионизованной водой и высушивали в потоке воздуха. АСМ-исследования проводили на мультимодовом атомно-силовом микроскопе "Наноскоп-IIIa" (Диджитал Инструментс, США) в режиме прерывистого контакта на воздухе с использованием кремниевых кантилеверов HA_NC (резонансная частота ~254 и 152 кГц, Типснано, Россия). Изображения обрабатывали с помощью программы "Фемтоскан" (Центр перспективных технологий, Россия) [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Типичные АСМ-изображения препарата белка NEP, нанесенного на поверхность свежесколотой слюды, представлены на рис.1. Наблюдаются глобулярные структуры различных размеров, варьирующих (по высоте) от ~1 до ~10 нм (рис.2а). Если глобулы высотой порядка 1 нм можно отнести к мономерам белка [3, 9], то более крупные объекты – к различным агрегатам (мультимерам). Гистограмма распределения белковых частиц по объему демонстрирует диапазон изменения объема от 100 до 2000 нм3, что с учетом уширения кантилевером белковых частиц может соответствовать олигомерным частицам, состоящим от нескольких единиц до нескольких десятков мономеров белка.
Кроме того, выявлено наличие вытянутых структур, представляющих собой тонкие нити диаметром ~1 нм и длиной 250–350 нм с глобулярными вытянутыми или сферическими утолщениями высотой до 14 нм (рис.1b). Разнообразие формы и различающихся в несколько раз размеров олигомеров NEP может свидетельствовать о том, что наблюдаемые структуры являются различными промежуточными структурами на пути к формированию более крупных агрегатов, зафиксированных ранее в экспериментах по светорассеянию [3]. Образование палочкообразных и червеобразных структур агрегатов NEP (рис.1c) может свидетельствовать о способности белка NEP к амилоидной агрегации [10].
ВЫВОДЫ
Впервые охарактеризованы морфология и размеры агрегатов белка NEP вируса гриппа А. Выявлено наличие глобулярных структур разного размера, а также фибриллярных, вытянутых, палочкообразных и червеобразных структур. Наблюдаемый полиморфизм структур может объясняться способностью NEP к амилоидной агрегации. Исследование амилоидной природы белка NEP, а также механизма формирования различных (амилоидных) агрегатов представляет колоссальный интерес для понимания физико-химических свойств NEP и их взаимосвязи с функцией данного белка в процессе инфицирования клеток хозяина. Понимание механизмов агрегации белка может открыть путь к разработке противовирусных препаратов нового поколения. Кроме того, возможности структурированной самосборки белков потенциально могут быть использованы для создания нанокапсул на основе природных материалов для адресной доставки лекарств.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-23-00395.
О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Eisfeld A.J., Neumann G., Kawaoka Y. At the centre: influenza A virus ribonucleoproteins, Nature Reviews Microbiology. 2015. Vol. 13. PP. 28–41. https://doi.org/10.1038/nrmicro3367
Paterson D., Fodor E. Emerging Roles for the Influenza A Virus Nuclear Export Protein (NEP), PLOS Pathogens. 2012. Vol. 8. P. e1003019. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003019
Golovko A.O., Koroleva O.N., Tolstova A.P., Kuz’mina N.V., Dubrovin E.V., Drutsa V.L. Aggregation of Influenza A Virus Nuclear Export Protein, Biochemistry Moscow. 2018. Vol. 83. PP. 1411–1421. https://doi.org/10.1134/S0006297918110111
Barinov N.A., Prokhorov V.V., Dubrovin E.V., Klinov D.V. AFM visualization at a single-molecule level of denaturated states of proteins on graphite, Colloids Surf., B. 2016. Vol. 146. PP. 777–784. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2016.07.014
Cao Y., Adamcik J., Diener M., Kumita J.R., Mezzenga R. Different Folding States from the Same Protein Sequence Determine Reversible vs Irreversible Amyloid Fate J. Am. Chem. Soc. 2021. Vol. 143. PP. 11473–11481. https://doi.org/10.1021/jacs.1c 03392
Golovko A.O., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Heterologous expression and isolation of influenza A virus nuclear export protein NEP, Biochemistry Moscow. 2017. Vol. 82. PP. 1529–1537. https://doi.org/10.1134/S0006297917120124
Lommer B.S., Luo M. Structural Plasticity in Influenza Virus Protein NS2 (NEP), Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 277. PP. 7108–7117. https://doi.org/10.1074/jbc.M109045200
Yaminsky I., Akhmetova A., Meshkov G. Femtoscan online software and visualization of nanoobjecs in high-resolution microscopy. Nanoindustry, 2018. Vol. 11. PP. 414–416. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2018.11.6.414.416
Dubrovin E.V., Koroleva O.N., Golovko A.O., Kuzmina N.V., Klinov D.V., Drutsa V.L. Atomic Force Microscopy Investigation of Influenza A Virus Nuclear Export Protein Aggregation, Microscopy and Microanalysis. 2019. Vol. 25. PP. 1342–1343. https://doi.org/10.1017/S143192761900744X
Koroleva O.N., Dubrovin E.V., Tolstova A.P., Kuzmina N.V., Laptinskaya T.V., Yaminsky I.V., Drutsa V.L. A hypothetical hierarchical mechanism of the self-assembly of the Escherichia coli RNA polymerase σ7° subunit, Soft Matter. 2016. Vol. 12. PP. 1974–1982. https://doi.org/10.1039/C5SM02934A
Научная статья
Исследование агрегатов белка ядерного экспорта вируса гриппа А с помощью атомно-силовой микроскопии
Е.В.Дубровин1, 2, д.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-8883-5966 / dubrovin@polly.phys.msu.ru
О.Н.Королева3, к.х.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0009-0001-2359-0723
Н.В.Кузьмина4, к.ф.-м.н., науч. сотр., ORCID: 0009-0003-3585-8066
В.Л.Друца5, к.х.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0009-0003-7780-9182
Аннотация. Белок ядерного экспорта (NEP) играет важную роль во внутриклеточных процессах при инфицировании клеток хозяина. В данной работе впервые с помощью атомно-силовой микроскопии выявлены и охарактеризованы агрегаты различной морфологии и размеров. Полученные результаты могут быть востребованы для разработки новых противовирусных препаратов и создания систем доставки лекарственных средств на основе NEP.
Ключевые слова: белок ядерного экспорта, вирус гриппа А, атомно-силовая микроскопия, агрегация белка
Для цитирования: Е.В. Дубровин, О.Н. Королева, Н.В. Кузьмина, В.Л. Друца. Исследование агрегатов белка ядерного экспорта вируса гриппа А с помощью атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 2. С. 114–118.
https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118
Received: 15.11.2023 | Accepted: 20.11.2023 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118
Original paper
STUDY OF INFLUENZA A VIRUS NUCLEAR EXPORT PROTEIN AGGREGATES USING ATOMIC FORCE MICROSCOPY
Е.V.Dubrovin1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-8883-5966 / dubrovin@polly.phys.msu.ru
О.N.Koroleva3, Cand. of Sci. (Chemistry), Senior Researcher, ORCID: 0009-0001-2359-0723
N.V.Kuzmina4, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Researcher, ORCID: 0009-0003-3585-8066
V.L.Drutsa5, Cand. of Sci. (Chemistry), Leading Researcher, ORCID: 0009-0003-7780-9182
Abstract. The nuclear export protein (NEP) plays an important role in intracellular processes during infection of host cells. In this paper, aggregates of various morphologies and sizes were identified and characterized for the first time using atomic force microscopy. The results obtained may be used for development of new antiviral drugs and developing of NEP-based drug delivery systems.
Keywords: Nuclear export protein, influenza A virus, atomic force microscopy, protein aggregation
For citation: Е.V. Dubrovin, О.N. Koroleva, N.V. Kuzmina, V.L. Drutsa. Study of influenza A virus nuclear export protein aggregates using atomic force microscopy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 2. PP. 114–118. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.2.114.118.
ВВЕДЕНИЕ
Белок ядерного экспорта NEP играет важную роль в жизненном цикле вируса гриппа А, включающую экспорт вирусных рибонуклеопротеинов из ядра инфицированной клетки на клеточную мембрану, регуляцию накопления вирусной геномной РНК и участие в высвобождении почкующихся вирионов [1, 2]. Ранее с помощью динамического рассеяния света была выявлена высокая агрегационная способность рекомбинантного белка NEP в различных условиях [3]. Наблюдался гетерогенный набор агрегатов NEP, типичные значения гидродинамического радиуса которых варьировали от нескольких нанометров до ~2,5 мкм. Тем не менее, детального исследования морфологии агрегатов NEP не проводилось. Целью данной работы было визуализировать и охарактеризовать агрегаты NEP дикого типа, полученных из телец включения, с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ зарекомендовала себя как эффективный инструмент для анализа различных молекул белка и белковых агрегатов [4, 5].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Белок NEP, соответствующий по структуре природному белку (без дополнительных модулей), экспрессировали в бактериальных клетках E. coli ER1821, содержащих плазмиду Eptrt-NEP, в которой ген белка находится под контролем промотора и терминатора РНК-полимеразы фага Т7. После подращивания и разрушения клеток белок выделяли в виде телец включения, как описано в работе [6]. Последующую дополнительную очистку проводили хроматографически по методике работы [7]. Белок (концентрация 0,3–3 мкг/мкл) хранили в буфере, содержащем 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 7,5, при 4 °C.
5–10 мкл раствора белка, разбавленного в 10–100 раз деионизованной водой или буфером, содержащим 10 мМ NaCl (pH 7,0), наносили на свежесколотую слюду на 10 мин, после чего промывали деионизованной водой и высушивали в потоке воздуха. АСМ-исследования проводили на мультимодовом атомно-силовом микроскопе "Наноскоп-IIIa" (Диджитал Инструментс, США) в режиме прерывистого контакта на воздухе с использованием кремниевых кантилеверов HA_NC (резонансная частота ~254 и 152 кГц, Типснано, Россия). Изображения обрабатывали с помощью программы "Фемтоскан" (Центр перспективных технологий, Россия) [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Типичные АСМ-изображения препарата белка NEP, нанесенного на поверхность свежесколотой слюды, представлены на рис.1. Наблюдаются глобулярные структуры различных размеров, варьирующих (по высоте) от ~1 до ~10 нм (рис.2а). Если глобулы высотой порядка 1 нм можно отнести к мономерам белка [3, 9], то более крупные объекты – к различным агрегатам (мультимерам). Гистограмма распределения белковых частиц по объему демонстрирует диапазон изменения объема от 100 до 2000 нм3, что с учетом уширения кантилевером белковых частиц может соответствовать олигомерным частицам, состоящим от нескольких единиц до нескольких десятков мономеров белка.
Кроме того, выявлено наличие вытянутых структур, представляющих собой тонкие нити диаметром ~1 нм и длиной 250–350 нм с глобулярными вытянутыми или сферическими утолщениями высотой до 14 нм (рис.1b). Разнообразие формы и различающихся в несколько раз размеров олигомеров NEP может свидетельствовать о том, что наблюдаемые структуры являются различными промежуточными структурами на пути к формированию более крупных агрегатов, зафиксированных ранее в экспериментах по светорассеянию [3]. Образование палочкообразных и червеобразных структур агрегатов NEP (рис.1c) может свидетельствовать о способности белка NEP к амилоидной агрегации [10].
ВЫВОДЫ
Впервые охарактеризованы морфология и размеры агрегатов белка NEP вируса гриппа А. Выявлено наличие глобулярных структур разного размера, а также фибриллярных, вытянутых, палочкообразных и червеобразных структур. Наблюдаемый полиморфизм структур может объясняться способностью NEP к амилоидной агрегации. Исследование амилоидной природы белка NEP, а также механизма формирования различных (амилоидных) агрегатов представляет колоссальный интерес для понимания физико-химических свойств NEP и их взаимосвязи с функцией данного белка в процессе инфицирования клеток хозяина. Понимание механизмов агрегации белка может открыть путь к разработке противовирусных препаратов нового поколения. Кроме того, возможности структурированной самосборки белков потенциально могут быть использованы для создания нанокапсул на основе природных материалов для адресной доставки лекарств.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-23-00395.
О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Eisfeld A.J., Neumann G., Kawaoka Y. At the centre: influenza A virus ribonucleoproteins, Nature Reviews Microbiology. 2015. Vol. 13. PP. 28–41. https://doi.org/10.1038/nrmicro3367
Paterson D., Fodor E. Emerging Roles for the Influenza A Virus Nuclear Export Protein (NEP), PLOS Pathogens. 2012. Vol. 8. P. e1003019. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003019
Golovko A.O., Koroleva O.N., Tolstova A.P., Kuz’mina N.V., Dubrovin E.V., Drutsa V.L. Aggregation of Influenza A Virus Nuclear Export Protein, Biochemistry Moscow. 2018. Vol. 83. PP. 1411–1421. https://doi.org/10.1134/S0006297918110111
Barinov N.A., Prokhorov V.V., Dubrovin E.V., Klinov D.V. AFM visualization at a single-molecule level of denaturated states of proteins on graphite, Colloids Surf., B. 2016. Vol. 146. PP. 777–784. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2016.07.014
Cao Y., Adamcik J., Diener M., Kumita J.R., Mezzenga R. Different Folding States from the Same Protein Sequence Determine Reversible vs Irreversible Amyloid Fate J. Am. Chem. Soc. 2021. Vol. 143. PP. 11473–11481. https://doi.org/10.1021/jacs.1c 03392
Golovko A.O., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Heterologous expression and isolation of influenza A virus nuclear export protein NEP, Biochemistry Moscow. 2017. Vol. 82. PP. 1529–1537. https://doi.org/10.1134/S0006297917120124
Lommer B.S., Luo M. Structural Plasticity in Influenza Virus Protein NS2 (NEP), Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 277. PP. 7108–7117. https://doi.org/10.1074/jbc.M109045200
Yaminsky I., Akhmetova A., Meshkov G. Femtoscan online software and visualization of nanoobjecs in high-resolution microscopy. Nanoindustry, 2018. Vol. 11. PP. 414–416. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2018.11.6.414.416
Dubrovin E.V., Koroleva O.N., Golovko A.O., Kuzmina N.V., Klinov D.V., Drutsa V.L. Atomic Force Microscopy Investigation of Influenza A Virus Nuclear Export Protein Aggregation, Microscopy and Microanalysis. 2019. Vol. 25. PP. 1342–1343. https://doi.org/10.1017/S143192761900744X
Koroleva O.N., Dubrovin E.V., Tolstova A.P., Kuzmina N.V., Laptinskaya T.V., Yaminsky I.V., Drutsa V.L. A hypothetical hierarchical mechanism of the self-assembly of the Escherichia coli RNA polymerase σ7° subunit, Soft Matter. 2016. Vol. 12. PP. 1974–1982. https://doi.org/10.1039/C5SM02934A
Отзывы читателей
