eng
Выпуск #6/2009
Н.Никитин, А.Сушко, О.Карпова, И.Яминский.
Структура и свойства нанокомплекса "ДНК — белок оболочки фитовируса"
Структура и свойства нанокомплекса "ДНК — белок оболочки фитовируса"
Просмотры: 3125
Свойства белков оболочки (БО) и капсидов фитовирусов позволяют использовать их в качестве матриц для создания новых материалов, вакцин и для адресной доставки биологически активных композиций в клетки животных и растений. Характерная особенность БО, из которых состоят капсиды, – их способность к самоорганизации в пространственно упорядоченные структуры и к селективной упаковке материала.
Капсиды представляют собой регулярные симметричные трехмерные структуры, имеющие достаточно малые размеры (от десятков до нескольких сотен нанометров), которые можно получать в большом количестве. Следует особо отметить, что капсиды вирионов можно подвергать как генетическим, так и химическим модификациям. Капсиды фитовирусов –
абсолютно биобезопасный материал, так как растительные вирусы не патогенны для человека и животных. Это делает БО вирусов растений перспективным материалом для использования в бионанотехнологиях.
Известно, что БО спирального фитовируса, типичного представителя потексвирусов – Х-вируса картофеля (ХВК) (рис.1), взаимодействует с вирионной рибонуклеиновой кислотой (РНК) с образованием наночастиц с вирионной структурой [1]. В статье изложены результаты изучения возможности образования дезоксирибонуклеопротеидных комплексов (ДНП) при инкубации белка оболочки ХВК с ДНК, приводятся результаты исследования структуры и свойств ДНП-частиц. Следует отметить, что ранее уже предпринимались попытки упаковки двухцепочечной ДНК в БО родственного потексвируса – вируса мозаики папайи, однако структура и свойства таких частиц не были исследованы [2].
Чтобы исследовать возможность упаковки ДНК в БО ХВК, БО инкубировались с молекулами ДНК со случайной последовательностью и различной длины (от 500 до 5000 п.н.). Полученные комплексы анализировались методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) (рис.2).
На микрофотографии видно, что ДНП представляют собой извитые частицы с ярко выраженной структурой, неоднородные по ширине и высоте. Морфология таких частиц заметно отличается от морфологии вирионов ХВК (см. рис.1). По данным АСМ было составлено распределение частиц ДНП по длинам. Оказалось, что максимум этого распределения соответствует средней длине свободной B-формы использованной ДНК. Из этого можно сделать вывод, что организация комплекса БО и ДНК в составе ДНП не соответствует нуклеосомной, иначе длина ДНП была бы меньше, чем у свободной ДНК. В то же время средние высоты ДНК и ДНП значительно различаются: средняя высота ДНП – 4 нм (см. рис.2), а высота свободной ДНК – 1 нм (рис.3).
Чтобы выяснить, образует ли БО ХВК при взаимодействии с ДНК регулярную спиральную структуру, аналогичную вирионной, полученные ДНП обрабатывались трипсином. Такая обработка позволяет выявить различия между БО в свободном состоянии и находящимся в составе белковой спирали вирусом А [3]. БО в составе вирусной частицы относительно устойчив к действию трипсина, при этом отщепляется лишь N-концевой пептид [4]. Обработка не собранных в вирусную спираль отдельных молекул БО приводит к образованию нескольких коротких пептидов. Этот подход был использован для изучения состояния БО в составе ДНП. После обработки ДНП трипсином обнаружить БО при электрофорезе в полиакриламидном геле в стандартных условиях не удалось, т.е. БО в составе ДНП расщепился на несколько коротких пептидов. Таким образом, можно сделать вывод о том, что структура БО в ДНП не соответствует структуре БО в нативном вирионе.
Для исследования структуры комплексов, образованных ДНК и БО ХВК, ДНП обрабатывались различными нуклеазами. Были использованы неспецифические нуклеазы, расщепляющие ДНК. После обработки ДНП нуклеазами обнаружить фрагменты ДНП или ДНК не удалось. Это свидетельствует о том, что ДНК в составе ДНП доступна действию нуклеаз и подверглась полному гидролизу, что в свою очередь указывает на неупорядоченность структуры БО в составе ДНП. При обработке ДНП специфическими нуклеазами (рестриктазами) ДНК в составе ДНП также расщеплялась. Известно, что использованные в работе рестриктазы проявляют ферментативную активность, связываясь с большой бороздкой ДНК [5]. Таким образом, можно предположить, что БО в составе ДНП не образует оболочку вокруг нуклеиновой кислоты, а связывается с малой бороздкой ДНК.
На основании полученных данных можно утверждать, что БО ХВК при инкубации с ДНК создает комплексы, принципиально отличающиеся по морфологии от вирионов ХВК и наночастиц, образованных РНК и вирусным белком.
Изучение структуры и свойств подобных наночастиц является необходимым этапом в создании сложных многофункциональных бионаноматериалов и в развитии молекулярной медицины.
Авторы выражают благодарность за поддержку Роснауке и Рособразованию (госконтракты: 02.512.11.2279, 02.513.11.3448, П255, П717, П973), программе УМНИК (проект № 10111, темы 14, 24), НАТО (Наука для мира) – CBN.NR.NRSFP 983204, Корейскому институту науки и технологий (проект KIST-MSU).
Литература
1. Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Y., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G (2006) Potato virus X RNA-mediated assembly of single-tailed ternary ‘coat protein-RNA-movement protein’ complexes. J Gen Virol. 87(9):2731–2740.
2. Erickson J.W., Bancroft J.B. (1980) The assembly of papaya mosaic virus coat protein with DNA. Prog. Clin. Biol. Res., 40, р. 293–300.
3. Rodionova N., Karpova O., Kozlovsky S., Zayakina O., Arkhipenko M., Atabekov J. (2003) Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. –J. Mol. Biol., 333, № 3, р. 565–572.
4. Koenig R., Tremaine J.H., Shepard J.F. (1978) In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the Nand C-termini. – J. Gen. Virol. 38, р. 2 329–337.
5. Branden C, Tooze J. (1999) Introduction to Protein Structure, 2nd, New York: Garland Publishing.
абсолютно биобезопасный материал, так как растительные вирусы не патогенны для человека и животных. Это делает БО вирусов растений перспективным материалом для использования в бионанотехнологиях.
Известно, что БО спирального фитовируса, типичного представителя потексвирусов – Х-вируса картофеля (ХВК) (рис.1), взаимодействует с вирионной рибонуклеиновой кислотой (РНК) с образованием наночастиц с вирионной структурой [1]. В статье изложены результаты изучения возможности образования дезоксирибонуклеопротеидных комплексов (ДНП) при инкубации белка оболочки ХВК с ДНК, приводятся результаты исследования структуры и свойств ДНП-частиц. Следует отметить, что ранее уже предпринимались попытки упаковки двухцепочечной ДНК в БО родственного потексвируса – вируса мозаики папайи, однако структура и свойства таких частиц не были исследованы [2].
Чтобы исследовать возможность упаковки ДНК в БО ХВК, БО инкубировались с молекулами ДНК со случайной последовательностью и различной длины (от 500 до 5000 п.н.). Полученные комплексы анализировались методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) (рис.2).
На микрофотографии видно, что ДНП представляют собой извитые частицы с ярко выраженной структурой, неоднородные по ширине и высоте. Морфология таких частиц заметно отличается от морфологии вирионов ХВК (см. рис.1). По данным АСМ было составлено распределение частиц ДНП по длинам. Оказалось, что максимум этого распределения соответствует средней длине свободной B-формы использованной ДНК. Из этого можно сделать вывод, что организация комплекса БО и ДНК в составе ДНП не соответствует нуклеосомной, иначе длина ДНП была бы меньше, чем у свободной ДНК. В то же время средние высоты ДНК и ДНП значительно различаются: средняя высота ДНП – 4 нм (см. рис.2), а высота свободной ДНК – 1 нм (рис.3).
Чтобы выяснить, образует ли БО ХВК при взаимодействии с ДНК регулярную спиральную структуру, аналогичную вирионной, полученные ДНП обрабатывались трипсином. Такая обработка позволяет выявить различия между БО в свободном состоянии и находящимся в составе белковой спирали вирусом А [3]. БО в составе вирусной частицы относительно устойчив к действию трипсина, при этом отщепляется лишь N-концевой пептид [4]. Обработка не собранных в вирусную спираль отдельных молекул БО приводит к образованию нескольких коротких пептидов. Этот подход был использован для изучения состояния БО в составе ДНП. После обработки ДНП трипсином обнаружить БО при электрофорезе в полиакриламидном геле в стандартных условиях не удалось, т.е. БО в составе ДНП расщепился на несколько коротких пептидов. Таким образом, можно сделать вывод о том, что структура БО в ДНП не соответствует структуре БО в нативном вирионе.
Для исследования структуры комплексов, образованных ДНК и БО ХВК, ДНП обрабатывались различными нуклеазами. Были использованы неспецифические нуклеазы, расщепляющие ДНК. После обработки ДНП нуклеазами обнаружить фрагменты ДНП или ДНК не удалось. Это свидетельствует о том, что ДНК в составе ДНП доступна действию нуклеаз и подверглась полному гидролизу, что в свою очередь указывает на неупорядоченность структуры БО в составе ДНП. При обработке ДНП специфическими нуклеазами (рестриктазами) ДНК в составе ДНП также расщеплялась. Известно, что использованные в работе рестриктазы проявляют ферментативную активность, связываясь с большой бороздкой ДНК [5]. Таким образом, можно предположить, что БО в составе ДНП не образует оболочку вокруг нуклеиновой кислоты, а связывается с малой бороздкой ДНК.
На основании полученных данных можно утверждать, что БО ХВК при инкубации с ДНК создает комплексы, принципиально отличающиеся по морфологии от вирионов ХВК и наночастиц, образованных РНК и вирусным белком.
Изучение структуры и свойств подобных наночастиц является необходимым этапом в создании сложных многофункциональных бионаноматериалов и в развитии молекулярной медицины.
Авторы выражают благодарность за поддержку Роснауке и Рособразованию (госконтракты: 02.512.11.2279, 02.513.11.3448, П255, П717, П973), программе УМНИК (проект № 10111, темы 14, 24), НАТО (Наука для мира) – CBN.NR.NRSFP 983204, Корейскому институту науки и технологий (проект KIST-MSU).
Литература
1. Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Y., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G (2006) Potato virus X RNA-mediated assembly of single-tailed ternary ‘coat protein-RNA-movement protein’ complexes. J Gen Virol. 87(9):2731–2740.
2. Erickson J.W., Bancroft J.B. (1980) The assembly of papaya mosaic virus coat protein with DNA. Prog. Clin. Biol. Res., 40, р. 293–300.
3. Rodionova N., Karpova O., Kozlovsky S., Zayakina O., Arkhipenko M., Atabekov J. (2003) Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. –J. Mol. Biol., 333, № 3, р. 565–572.
4. Koenig R., Tremaine J.H., Shepard J.F. (1978) In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the Nand C-termini. – J. Gen. Virol. 38, р. 2 329–337.
5. Branden C, Tooze J. (1999) Introduction to Protein Structure, 2nd, New York: Garland Publishing.
Отзывы читателей
