Современные ДНК-матрицы являются высокочувствительным и точным аналитическим инструментом для научного исследования различных аспектов биологии клеток. Технология ДНК-матриц находит все более широкое применение в фундаментальных и прикладных исследованиях и может использоваться в диагностике.

sitemap
Наш сайт использует cookies. Продолжая просмотр, вы даёте согласие на обработку персональных данных и соглашаетесь с нашей Политикой Конфиденциальности
Согласен
Поиск:

Вход
Архив журнала
Журналы
Медиаданные
Редакционная политика
Реклама
Авторам
Контакты
TS_pub
technospheramag
technospheramag
ТЕХНОСФЕРА_РИЦ
© 2001-2025
РИЦ Техносфера
Все права защищены
Тел. +7 (495) 234-0110
Оферта

Яндекс.Метрика
R&W
 
 
Вход:

Ваш e-mail:
Пароль:
 
Регистрация
Забыли пароль?
Книги по нанотехнологиям
Головнин В.А., Каплунов И.А., Малышкина О.В., Педько Б.Б., Мовчикова А.А.
Другие серии книг:
Мир материалов и технологий
Библиотека Института стратегий развития
Мир квантовых технологий
Мир математики
Мир физики и техники
Мир биологии и медицины
Мир химии
Мир наук о Земле
Мир электроники
Мир программирования
Мир связи
Мир строительства
Мир цифровой обработки
Мир экономики
Мир дизайна
Мир увлечений
Мир робототехники и мехатроники
Для кофейников
Мир радиоэлектроники
Библиотечка «КВАНТ»
Умный дом
Мировые бренды
Вне серий
Библиотека климатехника
Мир транспорта
Мир фотоники
Мир станкостроения
Мир метрологии
Мир энергетики
Книги, изданные при поддержке РФФИ
Выпуск #1/2007
Ю. Копа, К. Момыналиев.
ДНК-макроматрицы и транскрипционное профилирование
Просмотры: 4519
Современные ДНК-матрицы являются высокочувствительным и точным аналитическим инструментом для научного исследования различных аспектов биологии клеток. Технология ДНК-матриц находит все более широкое применение в фундаментальных и прикладных исследованиях и может использоваться в диагностике.
Основной задачей постгеномной эры исследований является использование информации о структуре генома для анализа биологических процессов в масштабах всего генома, а также поиска, установления и уточнения функций различных генов. Хотя молекулярная биология традиционно использует редукционный подход для решения биологических задач, давно известно, что экспрессия генов осуществляется путем их взаимодействия друг с другом, причем характерной особенностью процессов взаимодействия является их частая пространственная и временная разделенность. Для полного понимания биологии этих процессов молекулярные взаимодействия необходимо изучать через структуру всего генома. Современные биологические ДНК-матрицы являются высокочувствительным и точным аналитическим инструментом получения и обработки большого количества информации с тем преимуществом, что одновременно и быстро анализируется огромное количество образцов различного биологического материала. Благодаря своим особенностям технология ДНК-матриц все чаще применяется в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также может быть использована в диагностических целях. Так, применение ДНК-матриц в научных исследованиях различных аспектов биологии клеток позволяет проводить мониторинг экспрессии всех генов одновременно. Такой метод обеспечивает более целостный подход к изучению клеточной физиологии, тем самым дополняя традиционный "gene-by-gene"подход.

Теоретическая основа для создания биологических матриц появилась достаточно давно. Вскоре после того, как Джеймс Уотсон и Френсис Крик впервые сделали описание двойной спирали ДНК, было показано, что ДНК при нагревании или после обработки щелочью денатурируется, т.е. двойная спираль расплетается с образованием двух одноцепочечных фрагментов ДНК. Обратный процесс, лежащий в основе всех методов, включающих в себя ренатурацию и молекулярную гибридизацию, впервые был описан в 1961 году, когда было показано, что две последовательности ДНК, вовлеченные в образование дуплекса, должны обладать свойством комплементарности, и стабильность образованного дуплекса напрямую зависит от степени комплементарности образовавших его последовательностей. Благодаря открытию принципа комплементарной гибридизации нуклеиновых кислот представилась возможность анализировать степень сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот, стали быстро развиваться и использоваться для решения различных биологических задач методы, основанные на молекулярной гибридизации.
Одним из таких методов является технология ДНК-матриц, в основе которой лежит принцип специфической гибридизации фрагментов ДНК. Суть метода заключается в параллельной гибридизации смеси меченых нуклеиновых кислот (мишеней) с тысячами специфичных фрагментов нуклеиновых кислот (зондами), индентифицируемых пространственным положением в отдельных ячейках на матрице, в одном эксперименте. С помощью ДНК-матриц возможно получение полной и точной картины экспрессии генов в анализируемых образцах. В среднем в клетке постоянно используется только часть генов, в то время как оставшиеся репрессируются на транскрипционном или, что менее вероятно, на трансляционном уровне. Транскрипционный анализ, осуществляемый посредством экспрессионного профилирования на ДНК-матрицах, позволяет судить о процессах, происходящих в клетке, включая каскады биохимических реакций, различные регуляторные механизмы, а также механизмы патогенности (рис.1).
В течение последних лет были разработаны разнообразные методы детекции и количественного определения уровня экспрессии генов, такие как Northern Blotting,
S1-эндонуклеазный анализ гетеродуплексов, Differential Display RT-PCR, тотальное кДНК-секвенирование, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), среди которых и два метода на основе матриц – ДНК и олигонуклеотидных. Каждая из перечисленных технологий имеет свои преимущества и ограничения. Однако ДНК-матрицы обеспечивают наиболее эффективный способ сравнения уровнейэкспрессии тысяч генов при исследовании несколькихобразцов.
ДНК-матрицы представляют собой упорядоченную систему фрагментов нуклеиновых кислот, соответствующих определенным генам и находящихся в определенной позиции на матрице, которой может служить нейлоновая мембрана, стеклянная подложка или силикон. ДНК-микроматрицы содержат десятки тысяч элементов размером ~100 мкм в диаметре на стеклянной поверхности площадью в несколько квадратных сантиметров. Плотность нейлоновых матриц чуть меньше: тысячи ген-специфичных фрагментов ДНК (зондов) размещаются на поверхности, по площади не намного превосходящей стеклянные чипы.
В настоящее время в экспрессионном профилировании широко применяются 3 типа ДНК-матриц. Первый тип – это ДНК-матрицы, в которых пробы синтезируются in situ, то есть непосредственно на поверхности чипа. В двух других типах матриц пробы синтезируются независимо и затем наносятся на химически модифицированные стеклянные поверхности чипов. Природа проб позволяет их классифицировать, как двуцепочечные ДНК-матрицы (второй тип) и олигонуклеотидные ДНК-матрицы (третий тип).
Наиболее известными ДНК-матрицами, в изготовлении которых используется in situ-технология, являются матрицы GeneChip, выпускаемые компанией Affymetrix. Химический синтез олигонуклеотидных проб осуществляется на поверхности кварцевого стекла. Эта технология обеспечивает высокоплотное размещение проб – порядка 500 000 на одной ДНК-матрице размером 1,28х1,28 см. Для изготовления матриц GeneChip используется комбинация уникального метода фотолитографии (аналогичный метод используется для производства структур в микроэлектронике) и методов комбинаторной химии. Так как25-мерные последовательности слишком короткие для ген-специфичной гибридизации, каждая проба (match) сопровождается отрицательным контролем с одним отличным основанием в центре 25-мерной нуклеотидной цепи (mismatch). Такая пара проб используется для детекции и предотвращения кросс-гибридизации. Сеть олигонуклеотидов из 11-15 проб (перфектов) и такого же числа парных олигонуклеотидов с заменами (мисматчей) представляют один ген. Высокая плотность размещения проб на такой матрице позволяет иметь большое количество контролей. Автоматизированный процесс изготовления матриц GeneChip гарантирует высокую воспроизводимость результатов и позволяет варьировать условия проведения каждого эксперимента, тогда как обычно ДНК-матрицы гибридизируются с двумя различными флуоресцентно-мечеными мишенями (в качестве метки используется пара Cy-3/Cy-5), чипы Affymetrix – с одной меченой мишенью. Это позволяет использовать различные методы для мечения ДНК-мишеней, упрощает исследования и статистическую обработку результатов.
Для независимого синтеза ДНК-зондов, среди которых выделяют двухцепочечные фрагменты ДНК и олигонуклеотиды, используются различные методы. Один из них – полимеразная цепная реакция – позволяет получить ген-специфичные ампликоны размером от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Обычно, используя специфические праймеры, амплифицируют открытые рамки считывания, представляющие собой потенциальные белок-кодирующие последовательности. Оптимальная длина ампликонов для иммобилизации на ДНК-матрицах составляет 200-800 пар оснований, хотя фрагменты длиной до 1,3 тысяч пар оснований также используются. В таких матрицах каждый ДНК-зонд соответствует одному гену.
Двухнитевые фрагменты ДНК наносятся на положительно заряженную поверхность ДНК-матриц. Для модификации поверхности матриц обычно используется полилизин (poly-L-lysin) или 3-аминопропил-триметоксисилан (APS). Иммобилизация фрагментов ДНК на поверхности матрицы осуществляется благодаря электростатическому взаимодействию отрицательно заряженного фосфатного остова нуклеиновой кислоты и положительно заряженной поверхности матрицы, а также за счет образования ковалентных связей между остатками тимина и аминогруппами, расположенными на поверхности матрицы, при облучении ультрафиолетом. Среди преимуществ изготовленных таким образом матриц следует отметить высокую специфичность при гибридизации, высокую чувствительность и их низкую стоимость. В качестве альтернативы некоторые коммерческие поставщики предлагают большие коллекции 50-80-мерных олигонуклеотидов, синтезированных фосфорамидным методом. И в том, и в другом случае автоматическая локализация ДНК-зондов, находящихся в специальном буфере, на химически модифицированную поверхность матрицы осуществляется механическими роботами. Существуют две технологии нанесения: контактная и бесконтактная. Контактные роботы-принтеры наносят ДНК-зонды на поверхность матриц пинами различной формы (рис. 2), которые погружаются в раствор и переносят маленькие капельки специфических ДНК-зондов на поверхность матрицы. Размер локализованных таким образом ДНК-зондов составляет всего 150 мкм в диаметре. Бесконтактные принтеры используют технологию типа струйного принтера. Основное преимущество таких матриц – их стандартные размеры, что обеспечивает широкий выбор роботов-принтеров, оборудования для проведения гибридизации, лазерных сканеров и программного обеспечения для обработки результатов эксперимента. Исторически первым было изготовление ДНК-матрицы на предметном стекле, поэтому размер матриц 25x75 мм и толщина 1,0-1,2 мм не изменились. Однако плотность размещения ДНК-зондов на таких матрицах ниже по сравнению с матрицами Affymetrix – порядка 10 000-30 000 ДНК-зондов.
Для проведения эксперимента по транскрипционному профилированию готовые ДНК-матрицы гибридизируются со смесью меченой кДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции из мРНК изучаемых образцов. Каждый образец метится либо флуоресцентной (обычно используется пара Cy-3/Cy-5), либо радиоактивной меткой. Если мишени метятся радиоактивным методом, то можно провести только одну гибридизацию в эксперименте. Однако существует проблема подобного "одноканального" эксперимента – вариации в интенсивностях сигналов в пределах одного эксперимента влияют на конечную относительную экспрессионную картину. Эта проблема была решена с появлением "двухканальных" экспериментов, где два исследуемых образца РНК, один из которых, например, выступает в качестве контрольного, флуоресцентно метятся и одновременно гибридизируются с одной матрицей (рис.3). Для двухканального эксперимента мРНК выделяется из двух типов клеток, и один образец метится Сy-3, другой – Cy-5. Можно отметить, что наиболее распространено прямое мечение, когда метка является частью нуклеозид-трифосфата, например, Cy-3 диоксицитозин трифосфат (Cy-3 dCTP) или Cy-3 диоксиуридин трифосфат (Cy-3 dCTP). В случае радиоактивного мечения используются нуклеотиды, содержащие радиоактивный фосфатный остаток (обычно P33). Таким образом, мечение осуществляется путем встраивания нуклеотидов в кДНК в процессе ее синтеза.
Локализуясь в ходе гибридизации на матрице, анализируемые кДНК формируют детектируемые ген-специфичные сигналы – паттерны гибридизации, которые считываются конфокальным лазерным сканером. Для возбуждения поверхности гибридизированных ДНК-матриц в большинстве сканеров используются лазеры с разрешающей способностью в несколько микрон. Разрешающая способность сканера (устройство для сканирования показано на рис. 4) должна превышать величину, равную 10% от размеров локализации ДНК-зонда на матрице, то есть в случае зонда диаметром 150 мкм разрешение при сканировании должно быть, по крайней мере, 15 мкм. В результате сканирования получается изображение в формате TIFF для каждого канала (Cy-3/Cy-5) или GEL (при радиоактивном мечении).
Использование экспрессионных ДНК-матриц для анализа экспрессии всех генов становится все более актуальным в связи с появлением все большего числа полных геномных последовательностей для различных микроорганизмов, поскольку позволяет выявлять закономерности в экспрессии генов. Кроме того, несмотря на то, что ДНК-матрицы широко применяются при мониторинге экспрессии генов для определения их функции и состояния клеток, их также используют для определения числа копий ДНК, генетических мутации и детекции однонуклеотидных полиморфизмов.
В заключение можно привести несколько примеров успешного использования ДНК-матриц для фундаментальных и практических работ. В 2005 г. в журнале Science группой исследователей из компании Perlegen были опубликованы результаты генотипирования 1586383 полиморфизмов единичного нуклеотида (SNP) среди американцев, африканцев и азиатов. Было показано, что помимо общих SNPs (порядка 1200000), для каждой популяции можно выделить группу уникальных полиморфизмов, встречающихся только в определенной популяции. Полученные данные позволяют понять, почему те или иные заболевания встречаются только в определенных популяциях.
Для проведения анализа были сконструированы 49 высокоплотных олигонуклеотидных матриц, каждая из которых была предназначена для выявления 48 000 SNP. Работа была проведена в течение 1 месяца, в то время как использование традиционных методов определения полиморфизма единичных нуклеотидов заняло бы не менее 8 месяцев. В настоящее время компаниями Solexa и Helicos Biosciences предприняты попытки создания технологий на основе ДНК-матриц для определения нуклеотидной последовательности генома человека (порядка 3 млрд. нуклеотидов). Предполагается, что данные технологии позволят снизить стоимость определения генома человека с 15 млн. долл. (исследование занимает 6 месяцев) до 10 тыс. долл. в 2008 году и до 1000 долл. в 2010 году (исследование будет занимать одну неделю).
Одним из интересных направлений исследований является использования ДНК-матриц для открытия новых биологических маркеров различных заболеваний. Например, остро стоит проблема поиска ранних маркеров отторжения пересаженного органа. К сожалению, доступные на сегодняшний день методы (например, иммуногистохимия биопсий трансплантанта) позволяет зафиксировать признаки отторжения на поздних стадиях, что требует значительной иммуносупрессивной терапии. Технология ДНК-матриц является одним из методов выбора, позволяющих найти прогностические маркеры, с помощью которых можно достаточно точно оценить состояние трансплантанта в начальной стадии изменений, и, таким образом, своевременно провести корректировку трансплантанта с помощью незначительной терапии. С помощью этой технологии определен список потенциальных маркеров для ряда заболеваний, которые могут быть использованы в клинической практике.
Перспективы многопараметрического анализа на основе ДНК-матриц в настоящее время связаны с бурным развитием в области нанотехнологий. Прогресс в исследовании геномов обеспечивает значительное увеличение информации относительно механизмов заболеваний, роли целевых генов и белков в патогенезе, а, следовательно, приводит к тому, что все больше дополнительной информации (генов) должно добавляться к индивидуальным ДНК-матрицам. Это может быть достигнуто за счет уменьшения размеров ген-специфических фрагментов ДНК (зондов) до одного микрона или меньше. Обычные системы нанесения ДНК на матрицу позволяют формировать ДНК-матрицу, состоящую из элементов (зондов) размером 100 мкм, в то время как на коммерческих фотолитографических установках можно получать элементы размером до 20 мкм. Недавно NanoInk продемонстрировал DPN (Dip Pen Nanolithography) технологию, с помощью которой можно формировать элементы размером один микрон и меньше.
Известно, что затраты производства микроэлектронных компонентов при использовании фотолитографического процесса растут экспоненциально с уменьшением размеров элементов. Прямое изготовление ДНК-матриц с помощью DPN-технологии позволяет снизить эти производственные затраты и увеличить гибкость дизайна ДНК-матриц.
В настоящее время разработаны методы мягкой литографии, позволяющие иммобилизовать единичные молекулы ДНК на подложку, что делает возможным создание ДНК-наноматриц размером меньше 100 мкм (рис. 5). Потенциально, небольшие количества биологических материалов, как известно, имеют более быструю кинетику и более высокую чувствительность. Вероятно, что нанотехнологии будут использоваться для создания ДНК-чипов следующего поколения.
 
 Отзывы читателей
Разработка: студия Green Art