eng
Выпуск #5/2011
Х.Фишер
Новый метод формирования топографических рамановских изображений
Новый метод формирования топографических рамановских изображений
Просмотры: 2744
Комбинация системы конфокального рамановского отображения и оптического профилометра дает возможность получать конфокальные изображения распределения химических веществ по поверхности больших образцов. Дополнение рамановской и атомной силовой микроскопии новым методом обеспечивает значительные преимущества.
Теги: combination confocal raman image distribution profilometer комбинация конфокальное рамановское отображение профилометр распределение
Конфокальная рамановская микроскопия – мощный инструмент получения трехмерных химических изображений. Преимущество метода заключается, прежде всего, в возможности достижения высокого пространственного разрешения распределения веществ в образце (латеральное – до 200 нм, по глубине – до 500 нм), а также изучения кристалличности или механических напряжений в нем.
Метод позволяет качественно исследовать достаточно крупные образцы размером в несколько сантиметров, которые при измерении с глубинным разрешением меньше 1 мкм вследствие больших размеров обычно выглядят перекошенными или шероховатыми. При их исследовании многие участки не попадают в фокус конфокального микроскопа, однако использование конфокально-хроматических датчиков поверхностного профилометра в сочетании с конфокальным рамановским микроскопом позволяет изучать такие образцы. Наряду с исследованием топографии метод обеспечивает проведение дополнительной визуализации химических свойств на поверхности образца (топографическое рамановское отображение).
Конфокальное
рамановское отображение
Эффектом Рамана называют неупругое взаимодействие электромагнитного излучения с веществом. Падающий фотон изменяет колебательное состояние молекулы вещества и происходит испускание фотона со смещенной энергией. Сдвиг энергии между падающим и рассеянным фотонами характерен для вида и типа взаимодействия молекул, так что каждая молекула оставляет характерный след. Следовательно, рамановская спектроскопия – неразрушающий и неинвазивный метод, позволяющий получить детальную химическую информацию об образце без его серьезной подготовки или использования техники окрашивания. Для получения изображения используется конфокальный микроскоп в сочетании с высокочувствительной системой рамановской спектроскопии. Конфокальная микроскопия позволяет получить информацию только с фокальной плоскости, поскольку рассеянный свет из областей, находящихся вне этой плоскости, отфильтровывается апертурой. Получение изображения осуществляется растрированием образца или лазерным возбуждением точка за точкой и строка за строкой. Преимущество метода – высочайшая контрастность изображения и очень хорошее соотношение "сигнал–шум". Кроме того, удается получить глубинные профили и даже трехмерные изображения.
При использовании конфокального микроскопа в каждой точке изображения регистрируется полный рамановский спектр. В случае стандартного изображения в 256 строк по 256 пикселей формируется 65536 спектров. Из мультиспектрального файла с помощью специального программного обеспечения, например, интеграцией по определенным областям в спектре, можно также получить изображение распределения в образце химических веществ. На рис.1 показано конфокальное рамановское 3D-изображение эмульсии воды, масла и алкана, полученное с помощью микроскопа alpha300R. (Объем образца 30x30x11,5 мкм; 23 отдельных рамановских изображения, 150x150 пикселей, 22500 спектров на одно изображение; время съемки: одна минута на изображение, 23 мин на весь объем; цвета: зеленый – масло; красный – алкан; синий – вода.) На рис.2 показаны соответствующие спектры с цветовой кодировкой.
Конфокальный
хроматический датчик
для профилометрии
Конфокальный хроматический датчик позволяет определять бесконтактным способом топографию поверхности относительно больших образцов в нанометровой области.
На образце фокусируется луч из точечного источника белого света при помощи специальной линзы, которая в отличие от обычных оптических линз имеет максимально большую хроматическую погрешность. Это означает, что ее фокусное расстояние различно для каждого цвета: точка фокуса синего цвета находится гораздо ближе к линзе, чем для зеленого или красного.
Отраженный от образца свет улавливает маленькая диафрагма, после чего с помощью спектрометра выявляется его спектральный максимум. Таким образом, толщина образца определяется только при помощи отраженного света. Благодаря диафрагме в спектрометр попадает только свет, который находится в фокусе на поверхности образца. В результате посредством выявленного спектра точно определяется его высота. Сканирование образца позволяет определить топографию любого его участка, причем пока она находится в пределах хроматической погрешности линзы, необходимость наводить фокус повторно отсутствует. На рис.3 представлено топографическое измерение для фармацевтической таблетки.
Достоверное рамановское отображение поверхности
При профилометрическом измерении топографические координаты уже имеются, поэтому на следующем этапе могут быть получены рамановские спектры от поверхности таблетки. Итог обработки полученных результатов – распределение химических веществ по поверхности образца (рис.4).
Описанный выше новый метод True Surface Microscopy может применяться не только в фармацевтических исследованиях, но и в научно-исследовательских работах в области медицинской техники, наук о Земле, микроэлектроники, фотовольтаики, функциональных покрытий. ▪
Метод позволяет качественно исследовать достаточно крупные образцы размером в несколько сантиметров, которые при измерении с глубинным разрешением меньше 1 мкм вследствие больших размеров обычно выглядят перекошенными или шероховатыми. При их исследовании многие участки не попадают в фокус конфокального микроскопа, однако использование конфокально-хроматических датчиков поверхностного профилометра в сочетании с конфокальным рамановским микроскопом позволяет изучать такие образцы. Наряду с исследованием топографии метод обеспечивает проведение дополнительной визуализации химических свойств на поверхности образца (топографическое рамановское отображение).
Конфокальное
рамановское отображение
Эффектом Рамана называют неупругое взаимодействие электромагнитного излучения с веществом. Падающий фотон изменяет колебательное состояние молекулы вещества и происходит испускание фотона со смещенной энергией. Сдвиг энергии между падающим и рассеянным фотонами характерен для вида и типа взаимодействия молекул, так что каждая молекула оставляет характерный след. Следовательно, рамановская спектроскопия – неразрушающий и неинвазивный метод, позволяющий получить детальную химическую информацию об образце без его серьезной подготовки или использования техники окрашивания. Для получения изображения используется конфокальный микроскоп в сочетании с высокочувствительной системой рамановской спектроскопии. Конфокальная микроскопия позволяет получить информацию только с фокальной плоскости, поскольку рассеянный свет из областей, находящихся вне этой плоскости, отфильтровывается апертурой. Получение изображения осуществляется растрированием образца или лазерным возбуждением точка за точкой и строка за строкой. Преимущество метода – высочайшая контрастность изображения и очень хорошее соотношение "сигнал–шум". Кроме того, удается получить глубинные профили и даже трехмерные изображения.
При использовании конфокального микроскопа в каждой точке изображения регистрируется полный рамановский спектр. В случае стандартного изображения в 256 строк по 256 пикселей формируется 65536 спектров. Из мультиспектрального файла с помощью специального программного обеспечения, например, интеграцией по определенным областям в спектре, можно также получить изображение распределения в образце химических веществ. На рис.1 показано конфокальное рамановское 3D-изображение эмульсии воды, масла и алкана, полученное с помощью микроскопа alpha300R. (Объем образца 30x30x11,5 мкм; 23 отдельных рамановских изображения, 150x150 пикселей, 22500 спектров на одно изображение; время съемки: одна минута на изображение, 23 мин на весь объем; цвета: зеленый – масло; красный – алкан; синий – вода.) На рис.2 показаны соответствующие спектры с цветовой кодировкой.
Конфокальный
хроматический датчик
для профилометрии
Конфокальный хроматический датчик позволяет определять бесконтактным способом топографию поверхности относительно больших образцов в нанометровой области.
На образце фокусируется луч из точечного источника белого света при помощи специальной линзы, которая в отличие от обычных оптических линз имеет максимально большую хроматическую погрешность. Это означает, что ее фокусное расстояние различно для каждого цвета: точка фокуса синего цвета находится гораздо ближе к линзе, чем для зеленого или красного.
Отраженный от образца свет улавливает маленькая диафрагма, после чего с помощью спектрометра выявляется его спектральный максимум. Таким образом, толщина образца определяется только при помощи отраженного света. Благодаря диафрагме в спектрометр попадает только свет, который находится в фокусе на поверхности образца. В результате посредством выявленного спектра точно определяется его высота. Сканирование образца позволяет определить топографию любого его участка, причем пока она находится в пределах хроматической погрешности линзы, необходимость наводить фокус повторно отсутствует. На рис.3 представлено топографическое измерение для фармацевтической таблетки.
Достоверное рамановское отображение поверхности
При профилометрическом измерении топографические координаты уже имеются, поэтому на следующем этапе могут быть получены рамановские спектры от поверхности таблетки. Итог обработки полученных результатов – распределение химических веществ по поверхности образца (рис.4).
Описанный выше новый метод True Surface Microscopy может применяться не только в фармацевтических исследованиях, но и в научно-исследовательских работах в области медицинской техники, наук о Земле, микроэлектроники, фотовольтаики, функциональных покрытий. ▪
Отзывы читателей
