eng
Выпуск #4/2012
Е.Горшкова, С.Плескова, Э.Михеева
Атомно-силовая микроскопия клеток крови человека
Атомно-силовая микроскопия клеток крови человека
Просмотры: 3769
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) используется для изучения свойств биологических объектов и позволяет решать широкий спектр задач. Исследования направлены на изучение влияния флуоресцентных наночастиц на морфологию и упругие свойства мембран клеток крови человека. Изучение нейтрофилов показало, что под воздействием наночастиц происходят изменения в их морфологии, снижается упругость мембраны, наблюдается образование атипичных псевдоподий. Исследования показывают, что наночастицы – токсичные для клеток крови и подтверждают, что АСМ удобны и адекватны для биологических исследований.
Теги: atomic force microscopy fluorescent nanoparticles nanotoxicology neutrophils red blood cells атомно-силовая микроскопия нанотоксикология нейтрофилы флуоресцентные наночастицы эритроциты
С помощью АСМ возможно исследование проводящих и непроводящих веществ. Основное требование к ним – наличие структуры с достаточной степенью жесткости (объект не должен изменяться при механическом воздействии зонда). Большинство биологических объектов обладает этими свойствами и поэтому с помощью данного метода удается "увидеть" достаточно большое количество отдельных клеток и даже молекул [2]. Ярким примером может служить изучение эндотелиальных и эпителиальных клеток [3], ДНК [4], молекул коллагена [5].
Проведенные исследования направлены на изучение клеток крови – важнейшей физиологической и иммунологической составляющей внутренней среды человека. По их функциональному состоянию можно судить о патологических процессах в организме, что эффективно используется в лабораторной и медицинской практике.
Материалы и методы исследования
В работе исследовались свойства поверхности нейтрофилов и эритроцитов в нативном состоянии и под воздействием наноразмерных флюоресцентных частиц. Использовалась кровь здоровых доноров. Форменные элементы крови выделялись центрифугированием (40 мин, 1500 об/мин). Все измерения проводились на установке SOLVER BIO (NT-MDT, Зеленоград) (рис.1).
Установка входит в состав лаборатории АСМ научно-образовательного центра "Физика твердотельных наноструктур" ННГУ им.Лобачевского (Н.Новгород). Она включает оптический инвертированный микроскоп и установленную на нем измерительную АСМ-головку. Исследование топографии поверхности и упругих свойств клеток производились in vitro и в фиксированном состояниях в полуконтактном и контактном режимах.
Топография поверхности фиксированных клеток
Исследование зафиксированных образцов кроме удобства хранения и транспортировки имеет и другие преимущества. Например, зафиксировав клетки через определенное время после начала воздействия, можно сопоставить результаты, полученные от разных доноров или при различных условиях.
На базе лаборатории была создана сертифицированная методика измерений фиксированных нейтрофилов и лимфоцитов, в основе которой – их фиксация глутаровым альдегидом и последующие исследования на АСМ. Методика включает контактный режим измерения, как наиболее точно передающий топографические и размерные характеристики фиксированного биологического объекта. На АСМ-изображении четко визуализируются ядро и гранулы, причем существует возможность определения латеральных размеров нейтрофилов и их высоты (рис.2).
Активно разрабатываются флуоресцентные наноматериалы для биоимиджинга и исследуются механизмы их влияния на живые объекты. В экспериментах для этих целей применялись покрытые меркаптопропионовой кислотой квантовые точки CdSe/ZnS размером 12 нм производства ООО "НТИЦ "Нанотех-Дубна". Нейтрофильные гранулоциты инкубировались в их присутствии (30 мин, 37°C), а затем фиксировались. В результате образовывались атипичные псевдоподия, и визуализировалось полное или частичное разрушение клеток (рис.3).
Аналогичные исследования проводились с эритроцитами. На контрольных сканах наблюдались классические двояковогнутые диски с четко оформленными краями и впадинами диаметром 7,7±0,72 мкм. После воздействия квантовых точек морфология эритроцитов изменялась: клетки "набухали", их диаметр увеличивался до 11,2±0,98 мкм (рис.4). Таким образом, применив АСМ для изучения воздействия квантовых точек на нейтрофилы и эритроциты человека, удалось получить результаты, проиллюстрированные изображениями топографии клеток до и после воздействия этих точек.
Топография поверхности
и упругие свойства мембран живых клеток
В исследовании живых клеток использовались нейтрофилы. Благодаря рецепторам (селектинам и интегринам) поверхности этих клеток обладают хорошей адгезионной способностью и поэтому подходят для изучения методом АСМ в условиях, максимально приближенных к естественным. Выделенные нейтрофилы инкубировались в чашках Петри (Coning, США) (22–24°С, 10–15 мин). В результате происходила спонтанная адгезия клеток к подложке. Топография поверхности нативных клеток исследовалась в состоянии in vitro в полуконтактном режиме зондом DNP (Veeco, США) из нитрида кремния с золотым напылением. Кантилевер устанавливался на специальный держатель для работы в жидких средах и опускался в установленную на оптический микроскоп чашку Петри с клетками. Какие-либо значительные изменения в их морфологии в ходе контрольного сканирования (5–20 мин) не наблюдались (рис.5).
В качестве альтернативного "повреждающего" фактора использовались наночастицы, флюоресцирующие за счет комплексов редкоземельных элементов Yb, Er и являющиеся перспективными маркерами для биологических целей. После инкубации с такими наночастицами (30 мин, 37°С) наблюдались проявления их негативного воздействия, выражавшиеся в морфологических изменениях клеток (набухание, образование псевдоподий, разрушение и гибель) (рис.6).
Эти изменения можно было наблюдать в режиме реального времени и фиксировать интервал от начала исследований до определенного события, что относится к преимуществам рассматриваемой методики изучения живых клеток. Кроме того, имелась возможность исследовать упругие свойства мембран таких клеток до и после воздействия на них нанообъектов.
Для оценки ригидности мембран использовался метод силовых кривых, в котором применялся режим спектроскопии АСМ. Метод основан на измерении смещения кривой на графике диапазона отклонения кантилевера в зависимости от упругости поверхности исследуемого образца. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, рассчитанному согласно теории Герца [6], в которой рассматривается взаимоотношение жесткой полусферы (зонда) и бесконечной плоскости (биологического образца, площадь которого по сравнению с зондом бесконечно велика). Исследование поверхности клеток проводилось в физиологическом растворе с использованием контактных зондов MSCT-Au (Veeco, США). В экспериментах показатели упругости мембраны нейтрофилов сравнивались до и после добавления флюорофора. Для этого проводилось обзорное сканирование поля размером 60×60 мкм и выбиралось несколько клеток. После 20 контрольных измерений одной из клеток в чашку Петри добавлялись исследуемые наночастицы. После инкубации (30 мин, 37°С) проводилось 20 измерений на клетке, не подвергавшейся при контрольных измерениях механическому воздействию зонда. Это делалось во избежание совместного влияния – наночастиц и механического воздействия. Ригидность мембраны нативных клеток составила 26,46±2,49 кПа. Затем на клетки воздействовали наночастицами, в результате чего модуль Юнга мембраны нейтрофилов снижался до 19,07±3,34 кПа (рис.7).
Итак, метод АСМ позволяет решать широкий спектр задач и может применяться в том числе в новом направлении биологических исследований – нанотоксикологии. Следует подчеркнуть, что полученные результаты подкреплены такими классическими и зарекомендовавшими себя методами, как цитохимический и спектрофотометрический. В целом важно отметить, что легкость пробоподготовки, наглядность и высокая точность делают АСМ незаменимой для современных биологических исследований.
Литература
Ohnishi S., Murata M., Hato M. Correlation between Surface Morphology and Surface Forces of Protein A Adsorbed on Mica . – Biophys. J., 1988, v.74, p.455–465.
Touhami A., Othmane A., Ouerghi O., Ouada H.B., Fretigny C., Jaffrezic-Renault N. Red blood cells imaging and antigen-antibody interaction measurement . – Biomol. Eng., 2002, v.19(2–6), p.189–193.
Grimellec C., Lesniewska E., Cachia C., Schreiber J.P., Fornel F., Goudonnet J.P. Imaging of the Membrane Surface of MDCK Cells by Atomic Force Microscopy. – Biophys. J., 1994, v.67, p.36–41.
Lyubchenko Y, Shlyakhtenko L, Harrington R, Oden P., Lindsay S. Atomic force microscopy of long DNA: imaging in air and under water. – Proc Natl Acad Sci USA, 1993, v.90, p.2137–2140.
Гущина Ю.Ю., Плохов Р.А., Зевеке А.В. Исследование влияния обводнения, pH и модуляторов протеогликанов на морфологию фибрилл и субволокон коллагена. – Вестник Нижегородского университета им. Н.И.Лобачевского, 2007, № 1, с.114–118.
Hassan E.A., Heinz W.F., Antonik M.D., D’Costa N.P., Nageswaran S., Schoenenberger C.A., Hoh J.H. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. – Biophysical Journal., 1998, v.74, p.1564 –1578 .
Проведенные исследования направлены на изучение клеток крови – важнейшей физиологической и иммунологической составляющей внутренней среды человека. По их функциональному состоянию можно судить о патологических процессах в организме, что эффективно используется в лабораторной и медицинской практике.
Материалы и методы исследования
В работе исследовались свойства поверхности нейтрофилов и эритроцитов в нативном состоянии и под воздействием наноразмерных флюоресцентных частиц. Использовалась кровь здоровых доноров. Форменные элементы крови выделялись центрифугированием (40 мин, 1500 об/мин). Все измерения проводились на установке SOLVER BIO (NT-MDT, Зеленоград) (рис.1).
Установка входит в состав лаборатории АСМ научно-образовательного центра "Физика твердотельных наноструктур" ННГУ им.Лобачевского (Н.Новгород). Она включает оптический инвертированный микроскоп и установленную на нем измерительную АСМ-головку. Исследование топографии поверхности и упругих свойств клеток производились in vitro и в фиксированном состояниях в полуконтактном и контактном режимах.
Топография поверхности фиксированных клеток
Исследование зафиксированных образцов кроме удобства хранения и транспортировки имеет и другие преимущества. Например, зафиксировав клетки через определенное время после начала воздействия, можно сопоставить результаты, полученные от разных доноров или при различных условиях.
На базе лаборатории была создана сертифицированная методика измерений фиксированных нейтрофилов и лимфоцитов, в основе которой – их фиксация глутаровым альдегидом и последующие исследования на АСМ. Методика включает контактный режим измерения, как наиболее точно передающий топографические и размерные характеристики фиксированного биологического объекта. На АСМ-изображении четко визуализируются ядро и гранулы, причем существует возможность определения латеральных размеров нейтрофилов и их высоты (рис.2).
Активно разрабатываются флуоресцентные наноматериалы для биоимиджинга и исследуются механизмы их влияния на живые объекты. В экспериментах для этих целей применялись покрытые меркаптопропионовой кислотой квантовые точки CdSe/ZnS размером 12 нм производства ООО "НТИЦ "Нанотех-Дубна". Нейтрофильные гранулоциты инкубировались в их присутствии (30 мин, 37°C), а затем фиксировались. В результате образовывались атипичные псевдоподия, и визуализировалось полное или частичное разрушение клеток (рис.3).
Аналогичные исследования проводились с эритроцитами. На контрольных сканах наблюдались классические двояковогнутые диски с четко оформленными краями и впадинами диаметром 7,7±0,72 мкм. После воздействия квантовых точек морфология эритроцитов изменялась: клетки "набухали", их диаметр увеличивался до 11,2±0,98 мкм (рис.4). Таким образом, применив АСМ для изучения воздействия квантовых точек на нейтрофилы и эритроциты человека, удалось получить результаты, проиллюстрированные изображениями топографии клеток до и после воздействия этих точек.
Топография поверхности
и упругие свойства мембран живых клеток
В исследовании живых клеток использовались нейтрофилы. Благодаря рецепторам (селектинам и интегринам) поверхности этих клеток обладают хорошей адгезионной способностью и поэтому подходят для изучения методом АСМ в условиях, максимально приближенных к естественным. Выделенные нейтрофилы инкубировались в чашках Петри (Coning, США) (22–24°С, 10–15 мин). В результате происходила спонтанная адгезия клеток к подложке. Топография поверхности нативных клеток исследовалась в состоянии in vitro в полуконтактном режиме зондом DNP (Veeco, США) из нитрида кремния с золотым напылением. Кантилевер устанавливался на специальный держатель для работы в жидких средах и опускался в установленную на оптический микроскоп чашку Петри с клетками. Какие-либо значительные изменения в их морфологии в ходе контрольного сканирования (5–20 мин) не наблюдались (рис.5).
В качестве альтернативного "повреждающего" фактора использовались наночастицы, флюоресцирующие за счет комплексов редкоземельных элементов Yb, Er и являющиеся перспективными маркерами для биологических целей. После инкубации с такими наночастицами (30 мин, 37°С) наблюдались проявления их негативного воздействия, выражавшиеся в морфологических изменениях клеток (набухание, образование псевдоподий, разрушение и гибель) (рис.6).
Эти изменения можно было наблюдать в режиме реального времени и фиксировать интервал от начала исследований до определенного события, что относится к преимуществам рассматриваемой методики изучения живых клеток. Кроме того, имелась возможность исследовать упругие свойства мембран таких клеток до и после воздействия на них нанообъектов.
Для оценки ригидности мембран использовался метод силовых кривых, в котором применялся режим спектроскопии АСМ. Метод основан на измерении смещения кривой на графике диапазона отклонения кантилевера в зависимости от упругости поверхности исследуемого образца. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, рассчитанному согласно теории Герца [6], в которой рассматривается взаимоотношение жесткой полусферы (зонда) и бесконечной плоскости (биологического образца, площадь которого по сравнению с зондом бесконечно велика). Исследование поверхности клеток проводилось в физиологическом растворе с использованием контактных зондов MSCT-Au (Veeco, США). В экспериментах показатели упругости мембраны нейтрофилов сравнивались до и после добавления флюорофора. Для этого проводилось обзорное сканирование поля размером 60×60 мкм и выбиралось несколько клеток. После 20 контрольных измерений одной из клеток в чашку Петри добавлялись исследуемые наночастицы. После инкубации (30 мин, 37°С) проводилось 20 измерений на клетке, не подвергавшейся при контрольных измерениях механическому воздействию зонда. Это делалось во избежание совместного влияния – наночастиц и механического воздействия. Ригидность мембраны нативных клеток составила 26,46±2,49 кПа. Затем на клетки воздействовали наночастицами, в результате чего модуль Юнга мембраны нейтрофилов снижался до 19,07±3,34 кПа (рис.7).
Итак, метод АСМ позволяет решать широкий спектр задач и может применяться в том числе в новом направлении биологических исследований – нанотоксикологии. Следует подчеркнуть, что полученные результаты подкреплены такими классическими и зарекомендовавшими себя методами, как цитохимический и спектрофотометрический. В целом важно отметить, что легкость пробоподготовки, наглядность и высокая точность делают АСМ незаменимой для современных биологических исследований.
Литература
Ohnishi S., Murata M., Hato M. Correlation between Surface Morphology and Surface Forces of Protein A Adsorbed on Mica . – Biophys. J., 1988, v.74, p.455–465.
Touhami A., Othmane A., Ouerghi O., Ouada H.B., Fretigny C., Jaffrezic-Renault N. Red blood cells imaging and antigen-antibody interaction measurement . – Biomol. Eng., 2002, v.19(2–6), p.189–193.
Grimellec C., Lesniewska E., Cachia C., Schreiber J.P., Fornel F., Goudonnet J.P. Imaging of the Membrane Surface of MDCK Cells by Atomic Force Microscopy. – Biophys. J., 1994, v.67, p.36–41.
Lyubchenko Y, Shlyakhtenko L, Harrington R, Oden P., Lindsay S. Atomic force microscopy of long DNA: imaging in air and under water. – Proc Natl Acad Sci USA, 1993, v.90, p.2137–2140.
Гущина Ю.Ю., Плохов Р.А., Зевеке А.В. Исследование влияния обводнения, pH и модуляторов протеогликанов на морфологию фибрилл и субволокон коллагена. – Вестник Нижегородского университета им. Н.И.Лобачевского, 2007, № 1, с.114–118.
Hassan E.A., Heinz W.F., Antonik M.D., D’Costa N.P., Nageswaran S., Schoenenberger C.A., Hoh J.H. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. – Biophysical Journal., 1998, v.74, p.1564 –1578 .
Отзывы читателей
