eng
Выпуск #5/2013
О.Синицына, Г.Мешков, И.Яминский
Определение формы острия зонда в атомно-силовой микроскопии
Определение формы острия зонда в атомно-силовой микроскопии
Просмотры: 5401
При определении параметров острия зонда сканирующего атомно-силового микроскопа (АСМ) с использованием нанообъектов с известными размерами возникают принципиальные методические проблемы. Заключаются они в сложности нахождения образцов с заранее известными размерами. В статье обсуждается спектр связанных с этими проблемами вопросов.
Теги: cantilever cканирующая зондовая микроскопия nanoparticles scanning probe microscopy tip tobacco mosaic virus вирус табачной мозаики зонд кантилевер наночастица
Искусственные неорганические наночастицы практически всегда имеют разброс геометрических параметров. Их синтез обычно определяется физическими законами и используемыми химическими процессами. Однако точность и воспроизводимость размеров частиц обычно слабо поддаются контролю. Помимо этого при закреплении на подложке из-за влияния поверхностных сил на границе раздела фаз, которые для нанометрового масштаба оказывают существенное влияние на объект, может происходить изменение его размера.
На рис.1 приведены топограммы поверхностей кремния и сапфира, на которые нанесены наночастицы, не очень удобные для зондовой микроскопии, поскольку вследствие округлой формы имеют меньшую адгезию к поверхности, чем цилиндрические или прямоугольные. На рис.2 представлена гистограмма распределения наночастиц по размерам.
Наночастицы не имеют строго одинакового размера, однако сила их взаимодействия с поверхностью сравнима с силой воздействия зонда на эти частицы, что затрудняет их измерение методами зондовой микроскопии и приводит к искажению наблюдаемых размеров. Измеряемые латеральные размеры наночастиц существенно отличаются от вертикальных и варьируются вследствие уширения зондом.
Удачными нанообъектами являются структуры живой природы – нуклеиновые кислоты, белки, вирусы, липидные слои, липосомы, фрагменты клеток, но и здесь могут возникать проблемы. Так, по данным электронной микроскопии, двухцепочечная ДНК имеет диаметр в 2,0 нм, однако наблюдаемые в АСМ ее размеры могут широко варьироваться: для подложек слюды и высокоориентированного пиролитического графита с модификатором поверхности высота находиться в диапазоне 0,5–1,5 нм, ширина изменяется от десятков до сотен нанометров.
Измеряемые высота и ширина молекул ДНК зависят от условий наблюдения – влажности воздуха, используемой подложки. При меньшей влажности ее высота и ширина меньше. В результате наличия перечисленных артефактов молекулы ДНК не следует использовать в качестве калибровочных объектов для атомно-силовой микроскопии.
Белки обладают сложной пространственной структурой и собираются в наночастицы, не имеющие примитивной геометрии, например, вид шаров. При осаждении из-за различной ориентации белковых молекул на поверхности подложки их наблюдаемые высота и ширина будут различаться.
Наилучшие объекты для определения пространственного разрешения – природные наночастицы с выраженной симметрией. К ним относятся вирусные частицы, имеющие форму икосаэдра или протяженного цилиндра. Именно протяженные вирусные частицы с круговым поперечным сечением – наиболее удачны для калибровки. При этом среди вирусов целесообразнее выбирать частицы с наибольшей жесткостью. Также следует использовать растительные вирусы, так как они не представляют опасности для человека.
Для работы был выбран вирус табачной мозаики (ВТМ) по следующим причинам:
он обладает большей механической жесткостью среди других доступных вирусов –картофеля А и Х, семилатентного мятлика;
поперечный диаметр вируса лежит в диапазоне 10–20 нм, его длина – 300 нм. Вирус такой продолговатой формы легко отличить на подложке от других объектов, которые могут присутствовать в исходном растворе – примесей и чужеродных частиц;
ВТМ – наиболее распространенный объект вирусологических исследований, его выделение из зараженных растений отработано в полной мере;
это недорогой и доступный биологический препарат.
Наилучшим нанообъектом с известным динамическим размером можно считать меру перемещений – измерительную меры латерального перемещения на основе пьезокерамической пластины [1]. Она в состоянии обеспечить воспроизводимое перемещение длиной в 1 нм с точностью на уровне сотых долей нанометра.
В атомно-силовой микроскопии можно выделить два режима сканирования: контактный и резонансный. Они используются для исследования топографии поверхности. Геометрические параметры острия зонда оказывают значительное влияние на передачу формы объектов, поэтому важна калибровка параметров зонда.
В контактном режиме ключевые параметры: сила воздействия зонда на поверхность, скорость сканирования, обратная связь. Сила выбирается таким образом, чтобы нанообъекты, использующиеся для калибровки параметров зонда, не разрушались. На воспроизведение формы объектов значительно влияет подбор параметров работы обратной связи, оптимальные значения которых зависят, в том числе, и от скорости сканирования. Их настройка должна быть выполнена в соответствии с инструкцией по эксплуатации используемой модели АСМ.
В резонансном режиме сканирования ключевые параметры: амплитуды колебаний зонда (свободных и у поверхности образца), частота колебаний, скорость сканирования, настройка обратной связи. Первые два параметра выбираются так, чтобы исключить разрушение образца при сканировании. Остальные параметры устанавливаются в соответствии с инструкцией по эксплуатации микроскопа.
Важный момент – выбор размера используемых изображений. В зондовой микроскопии используется разрешение 512×512 точек. Чем меньше размер кадра, тем больше точек приходится на профиль нанообъекта. Однако при большем размере кадра в поле зрения попадает большее количество нанообъектов. В случае использования ВТМ это важно, так как наночастица вируса имеет форму цилиндра. Для корректной калибровки зонда АСМ вирусная частица должна попасть полностью в кадр, размер которого должен превышать 210 нм. Частицы ВТМ склонны к агрегации, что проявляется в стыковке вирусных частиц и их преимущественной ориентации по оси цилиндра. С учетом отмеченных особенностей, может быть рекомендован размер кадра в 1000 нм (рис.3). Диаметр вирусной частицы составляет 49,8 нм. Разрешение изображения 0,512 точек/нм. На профиль одной вирусной частицы приходится 25 точек.
Для описания численного алгоритма восстановления формы зонда необходимо дать определение операциям расширение и эрозия. Расширение, примененное к объекту А со структурным элементом B, приводит к увеличению объема объекта, которое контролируется размерами и формой элемента:
A⊕B= ⋃(A+b).
b∈B
Эрозия объекта А со структурным элементом B приводит к обратному эффекту – уменьшению объема объекта, контролируемого размерами и формой элемента:
AB=⋂(A–b).
b∈B
Тенью поверхности s(x, y) называются все точки множества
S = {(x, y, z) | z ≤ s (x, y)}.
Если считать, что положение кончика острия зонда в каждой точке определяет профиль АСМ-изображения, то его можно получить из выражения: I=S⊕(-T), где I – тень поверхности изображения, S – тень поверхности образца, -T – тень инвертированной поверхности зонда относительно центра координат (вершины острия зонда).
Известны два наиболее популярных алгоритма восстановления формы острия зонда по отснятому изображению [2, 3]:
неразрушающее поверхность острие (Non-distortion tip);
слепая аппроксимация острия (Blind tip estimation).
Алгоритм неразрушающего
поверхность острия
Он предполагает, что в каждой точке кончик острия зонда касается поверхности образца, а АСМ-изображение описывает эту поверхность без искажений ее формы. Зонд (Tnd) задается формулой:
Tnd=–(II).
Формула устанавливает предел сверху для формы зонда, так как более тупыми зондами, чем Tnd получить АСМ-изображение для заданной поверхности образца невозможно.
Алгоритм слепой аппроксимации острия
Он предполагает, что в ряде точек зонд касается поверхности боковыми частями острия, а не кончиком. Таким образом, в этих точках АСМ-изображение не отражает истинную поверхность образца. Данный алгоритм построен на итерационной схеме:
-Ti+1=⋂x∈I[(I-x)⊕Pi’ (x)]∩(-Ti),
где Pi’ (x) определяется выражениями:
Pi’ (x)={d|d∈Pi и 0∈I-x+d},
где d – вектор, соединяющий вершину острия инвертированного зонда с точкой касания его боковой поверхности образца (инвертированный зонд P определяется соотношением
P = -T). Это выражение задает ограничение на точки касания, при которых острие зонда может прокалывать поверхность образца.
Функция расчета параметров зонда сканирующего АСМ была интегрирована в программное обеспечение (ПО) ФемтоСкан Онлайн, версия 1.7. Для расчета формы зонда в меню выбирается Mathematics/Morphologicals filters.
При запуске команды Non-distorting tip рассчитывается максимально тупая форма иглы, которая при сканировании не вносит искажений в изображение или его часть. Считается, что данное изображение – точная копия поверхности, и ищется игла, которая может обеспечить такое сканирование.
Фильтр Blind tip estimation тоже вычисляет максимально тупую форму иглы, с помощью которой можно получить изображение или его часть. Однако в этом случае отсутствует требование неискаженности поверхности; на форму иглы действует ограничение другого рода. Если производится сканирование иглой с некоторым радиусом кривизны, на изображении не появятся выпуклые объекты с большей кривизной. Таким образом, выпуклости на поверхности ограничивают форму иглы. При запуске такого фильтра появляется окошко с индикатором прогресса. В ходе работы фильтра производятся итерации, и ожидается, что результат следующей итерации будет отличаться от предыдущей. Если при очередной итерации изменений в форме иглы не происходит, работа фильтра завершается. Примеры применения функций по расчету формы иглы приведены на рис.4 и 5.
При использовании ВТМ в качестве объекта для аппроксимации острия зонда измерения его размеров можно проводить в одном из двух режимов: контактном или резонансном (теппинг). Для измерений используют кантилевер, параметры острия, которого необходимо установить.
При сканировании образца выбирается минимальная сила в контактном режиме или наименьшее изменение амплитуды колебаний кантилевера в резонансном режиме. Скорость сканирования в контактном режиме должна находиться в диапазоне 1–5 Гц, в резонансном – 0,3–1 Гц. Рекомендуемый размер кадра 1×1 мкм2. На изображении должны быть четко видны частицы ВТМ.
Обработку данных с помощью ПО ФемтоСкан Онлайн можно проводить при проведении измерений и после их окончания (рис.6). Описание этого ПО находится в свободном доступе: www.nanoscopy.net/downloads/FemtoScan/FSOnlineManual_ru.pdf
Полученное изображение ВТМ подвергается следующей обработке:
удаляется средний наклон, рассчитанный по методу наименьших квадратов;
выравниваются строки по высоте;
проводится медианная фильтрация (при наличии единичных шумовых выбросов).
По изображению ВТМ (1×1 мкм2, 512×512 точек) рассчитывается форма острия зонда с использованием функции программного обеспечения mathematics/morphological filters/blind tip estimation. Максимальный размер зонда устанавливается равным 50. По завершении вычислений в программе появляется окно с изображением острия зонда (рис.7).
Расчет угла раствора конуса
при вершине острия
По изображению строятся пять сечений зонда, проходящих через его вершину и повернутых относительно друг друга на 36о. По сечению рассчитываются координаты точек треугольника при вершине зонда (рис.8).
Точки имеют следующие координаты (нм):
А (0,0); B (xB,10); C (xC,0). Таким образом, по сечениям необходимо определить только координаты xB и xC.
Угол раствора конуса при вершине острия для i сечения
.
Средний угол раствора конуса при вершине острия:
β= ∑iβi .
5
Погрешность определения угла раствора конуса при вершине острия:
Sβ= ∑i(β-βi)2 .
4
Расчет радиуса скругления острия зонда
Так как форма острия неоднозначно аппроксимируется поверхностью сферы, принято рассчитывать радиус скругления на высоте 10 нм от вершины острия. Для этого строится изолиния на высоте 10 нм от этой вершины (рис.9). Программа автоматически рассчитывает длину линии и площадь поверхности. Для расчета радиуса скругления острия (R) используется значение длины изолинии (L): R = L / (2π).
Для нахождения погрешности определения радиуса используются результаты, полученные при расчете угла раствора конуса острия зонда, поскольку значения xC являются диметрами зонда, измеренными на высоте 10 нм от вершины острия. Тогда погрешность определения радиуса скругления
SR=∑i(R – xC i /2)2 .
5
Алгоритм расчета формы острия зонда позволит восстановить его форму только в том случае, если для калибровки использованы объекты в виде недеформируемых игл с диаметром, стремящимся к нулю. Поскольку аналогов таких объектов не существует, предложено для калибровки использовать частицы ВТМ цилиндрической формы с радиусом сечения 8±0,85 нм. Для игл с меньшим радиусом скругления острия могут быть получены некорректные данные.
При расчете угла раствора конуса при вершине зонда для определения погрешностей калибровки предложено проводить измерения для пяти сечений, проведенных через вершину острия зонда и повернутых относительно друг друга на 36о. Разброс значений связан с погрешностью измерений и с асимметричной формой острия.
При расчете радиуса скругления для определения погрешностей калибровки предложено измерять среднеквадратичное отклонение радиуса зонда, вычисленного по длине изолинии, от радиусов, измеренных по сечениям, проведенным через вершину острия и повернутым друг к другу на 36о. Среднеквадратичное отклонение будет определяться погрешностью измерения радиуса зонда и асимметрией формы острия.
В большинстве случаев зонды для АСМ делаются из кристаллических материалов. Их острие должно иметь огранку, на форму которой может оказывать влияние появление слоя оксида при хранении изделий на воздухе. Если предположить, что острие имеет сечение в форме угла, то невозможно аппроксимировать сечение кончика зонда окружностью, не задав характерного масштаба, поскольку в угол можно вписать окружность любого радиуса. Так как АСМ преимущественно используется для анализа нанобъектов, предложено в качестве такого масштаба выбрать высоту в 10 нм от вершины острия.
Параметры острий зондов, определяемые по рассчитанным их изображениям, могут быть измерены по изображениям с помощью электронного микроскопа. Для этих целей в работе использовался микроскоп Hitachi S-520. Типичные изображения зондов показаны на рис.10. Видно, что в процессе эксплуатации к острию зонда могут присоединяться различные частицы с поверхности образца. Изображения также показывают, что зонды имеют огранку.
Пример определения параметров зонда по изображениям, полученным на электронном микроскопе, показан на рис.11. Достигнутого пространственного разрешения явно недостаточно для точного измерения параметров острия на высоте 10 нм от вершины зонда. Размер пикселя ~5 нм. Если измерять угол сходимости конуса при вершине острия на изображении с низким увеличением, для стандартных зондов он составил ~42o (рис.11а). На изображениях видно, что вблизи острия отсутствует острый угол. Оценочные измерения по изображениям, полученным на электронном микроскопе, показывают, что типичный угол раствора конуса при вершине острия ~130o. Оценка радиуса скругления на высоте 10 нм от вершины острия дает ~50 нм. Если сравнить данные с полученными по методике, использующей численный расчет формы зонда по АСМ-изображению, можно заключить, что угол раствора конуса при вершине острия зонда и радиус скругления ниже, чем в случае определения параметров по изображениям электронной микроскопии. Это связано с недостаточным разрешением изображений, полученных с помощью электронного микроскопа, что приводит к сглаживанию деталей острия зонда, которые могут вносить значительный вклад в АСМ-изображения.
Авторы выражают благодарность за поддержку работы Фонду инфраструктурных и образовательных программ РОСНАНО.
Литература
Мешков Г., Синицына О., Яминский Д., Яминский И. Динамическая измерительная мера "Нанометр". – Наноиндустрия, 2012, №6, с.40–43.
Villarrubia J.S. Morphological estimation of tip geometry for scanned probe microscopy. – Surface Science, 1994, v.321, р.287–300.
Villarrubia J.S. Algorithms for Scanned Probe Microscope Image Simulation, Surface Reconstruction, and Tip Estimation. – J. Res. Natl. Inst. Stand. Technol, 1997, v.102, р.425–454.
Artificial inorganic nanoparticles practically always have a variety of geometrical parameters. Their synthesis is usually determined by the physical laws and used chemical processes. However, usually the accuracy and reproducibility of the particles’ sizes can hardly be controlled. Besides, when fixed on a substrate, due to the influence of the surface forces on the boundary of separation of phases, which, because of a nano-meter scale, can influence an object considerably, their sizes may change.
Fig.1 presents topograms of silicon and sapphire surfaces with nanoparticles on them, which are not so convenient for a probe microscopy because of their roundish forms, less adhesive to the surfaces, than the cylindrical or rectangular forms. Fig.2 presents a histogram of distribution of the nanoparticles by their sizes.
Nanoparticles do not have a strictly identical size, however the force of their interaction with a surface is comparable with the force of influence of a probe on such particles, which complicates their measurement by the methods of probe microscopy and leads to distortion of the observable sizes. The measured lateral sizes of nanopaticles differ essentially from the vertical ones and vary owing to their widening by a probe.
Convenient nano-objects are wildlife structures – nucleic acids, proteins, viruses, lipide layers, liposomes and fragments of cells, but here, too, problems may arise. So, according to the electronic microscopy, a two-chained DNA has a diameter of 2.0 nm, however, its sizes observed in АFМ can vary widely:
For substrates of mica and highly-orientated pyrolitic graphite with a surface modifier its height is within the range of 0.5–1.5 nm,
Its width varies from tens up to hundreds of nanometers.
The measured height and width of DNA molecules depend on the observation conditions – humidity of air and the used substrate. With lower humidity its height and width are less. Because of the above listed facts a DNA molecule should not be used as a calibration sample in the atomic-force microscopy.
Proteins have a complex spatial structure and gather into nanoparticles without a primitive geometry, for example, a kind of spheres. As a result of sedimentation due to various orientations of the protein molecules on a substrate surface their observed height and width will differ.
The best objects for determination of a spatial resolution are natural nanoparticles with a pronounced symmetry. Among them are virus particles, which have a form of an icosahedron or a lengthy cylinder. Exactly the lengthy virus particles with circular cross-section are the most convenient for calibration. At that among viruses it would be more expedient to select particles with the greatest rigidity. It is also recommended to use vegetative viruses, since they are not hazardous for people.
For this work the tobacco mosaic virus (TMV) was selected due to the following reasons:
It has the greatest mechanical rigidity among the other available viruses – of A and X potatoes and semilatent meadow grass;
The cross-section diameter of the virus is within the range of 10–20 nm, its length is 300 nm. The virus of such an oblong form is easy to distinguish on a substrate from the other objects, which can be present in an initial solution – impurities and alien particles;
TMV is the most widespread object in virological researches, the technology of its isolation from the infected plants is well-known;
It is an inexpensive and accessible biological preparation.
The best nano-object with a known dynamic size can be considered a movement measure –measure of a lateral movement based on a piezoceramic plate [1]. It can ensure a reproducible movement of one nanometer length with the accuracy at the level of 100-th shares of a nanometer.
In the atomic-force microscopy it is possible to single out two modes of scanning: contact and resonance ones. They are used for research of a surface topography. The geometrical parameters of the edge of a probe has a considerable impact on the vision of the objects’ form, therefore, calibration of the probe parameters is very important.
The key parameters in the contact mode are the force of influence of a probe on a surface, speed of scanning, feedback. The force is selected in a way not damaging the nano-objects used for calibration of the probe parameters. The reproduction of the objects’ form is influenced considerably by selection of the feedback operation parameters, the optimum values of which depend, among other things, on the speed of scanning. Their adjustment should be done in accordance with the operating instruction of the used АFМ model.
The key parameters in the resonance mode are amplitude of the probe vibrations (of the free ones and of the ones on the sample’s surface), frequency of vibrations, speed of scanning, and adjustment of the feedback. The first two parameters are selected to exclude destruction of a sample during scanning. The other parameters are established in accordance with the microscope operating instruction.
An important point is selection of the size of the used images. In probe microscopy the resolution of 512 х 512 points is used. The smaller is the size of a frame, the more points are in the profile of a nano-object. However, with a bigger size of a frame, more nano-objects are in sight. When TMV is used, this is important, since a nonoparticle of the virus has a cylinder form.
For an accurate calibration of an AFM probe a virus particle should be fully placed within the frame, the size of which must exceed 210 nm. TMV particles are prone to aggregation, which becomes apparent in their link-up and preferential orientation along the cylinder axis. Taking into account the above features, we would recommend the size of a frame of 1000 nm. (Fig.3). Diameter of a virus particle equals to 49.8 nm. The image resolution is 0.512 points/nm. There are 25 points per one virus particle profile.
In order to describe the numerical algorithm of restoration of a probe form we should make definitions of the operations of expansion and erosion. Expansion applied to object A with a structural element B leads to an increase of the volume of the object, which is controlled by the element’s sizes and form:
A⊕B= ⋃(A+b).
b∈B
Erosion of object A with a structural element B leads to a boomerang effect – to reduction of the volume of the object controlled by the size and the form of an element:
AB=⋂(A–b).
b∈B
The surface’s shadow s(x, y) is comprised of all the points of the set
S = {(x, y, z) | z ≤ s (x, y)}.
If we assume that the position of the probe edge in each point determines the profile of an AFM image, it can be obtained from the expression I=S⊕(-T), where I is the shadow of the image surface, S is the shadow of the sample’s surface, T is the shadow of the probe’s surface inverted in relation to the coordinate center (top of the probe edge).
Two most popular algorithms for restoration of the form of a probe tip by the filmed image [2, 3] are known:
Non-distortion tip (tip not destroying a surface);
Blind tip estimation (blind approximation of a tip).
Algorithm of the non-distortion tip
It assumes that in each point the tip of a probe edge touches the surface of a sample, while the AFM image describes this surface without distortion of its form. Probe (Tnd) is set by the formula:
Tnd=–(II).
The formula establishes the upper limit for the probe form, because it is impossible to obtain an AFM image for the set surface of the sample with more blunt probes than Tnd.
Algorithm of blind tip estimation
It assumes that in a number of points a probe touches the surface with the lateral parts of its edge, instead of its tip. Thus, in these points an AFM image does not reflect the true surface of the sample. The given algorithm is constructed on an iterative pattern:
-Ti+1=⋂x∈I[(I-x)⊕Pi’ (x)]∩(-Ti),
where Pi’ (x) is determined by the expression:
Pi’ (x)={d|d∈Pi и 0∈I-x+d},
where d – is the vector connecting the tip of the edge of the inverted probe with the contact point of its lateral surface of the sample (inverted probe P is determined by the parity P = -T). This expression sets restriction on the contact points, in case of which the probe edge can pierce the surface of a sample.
The function of calculation of the probe parameters of a scanning AFM was integrated into the software FemtoScan Online, version 1.7. For calculation of a probe form select Mathematics/Morphologicals filters in the menu.
When you start Non-distorting tip command, the maximally blunt form of a needle will be calculated, which does not cause distortions in the image or its parts during scanning. It is believed that the given image is an exact copy of the surface, and a respective needle is sought, which can ensure such scanning.
Blind tip estimation filter, too, calculates the maximally blunt form of a needle, with the help of which it is possible to obtain an image or its part. However in this case there is no requirement for nondistorted surfaces; the needle form is effected by restrictions of other sorts. If a scanning is done by a needle with a certain curvature radius, in the image there will be no convex objects with bigger curvature.
Thus, cambers on a surface restrict the needle’s form. When such a filter started, a window appears with the progress indicator. During the filter operation iterations are done, and it is expected, that the result of the following iteration will differ from the previous one. If another iteration brings no changes to the needle form, the filter terminates its operation. Examples of application of the functions for calculation of the form of a needle are presented in Fig.4 and Fig.5.
When TMV is used as an object for approximation of the edge of a probe, measurement of its size can be done in one of the two modes: contact mode or resonance (tapping) mode. For measurements a cantilever is used, the parameters of the edge of which should be established.
During scanning of a sample the minimum force is selected in a contact mode or the minimal change of the fluctuation amplitude of the cantilever in a resonant mode. The speed of scanning in the contact mode should be within the range of 1–5 Hz, and in the resonance mode – 0.3–1 Hz. The recommended size of the frame is 1х1 micrometer2. The TMV particles should be distinctly visible in the image.
Data processing with the help of FemtoScan Online software can be done during the process of measuring and after its termination (Fig.6). The description of this software is available in a free access: www.nanoscopy.net/downloads/FemtoScan/FSOnlineManual_ru.pdf
The obtained TMV image is processed in the following way:
– Average inclination calculated by the method of the minimal squares is removed;
– Lines are aligned by height;
– Median filtration is done (if individual noise emissions are present).
By TMV image (1×1 mcr2, 512×512 points) the form of a probe edge is calculated with the use of a function of the software mathematics/morphologicalfilters/blindtip estimation. The maximal size of a probe is established as equal to 50. When calculations are finished, a window appears in the program with the image of the probe edge (Fig.7).
Calculation of the angle of a cone
opening at the edge top
By the image five sections of the probe are constructed, passing through its top and turned by 36о in relation to each other. By the section the co-ordinate points of a triangle at the probe top are calculated (Fig.8)
The points have the following co-ordinates in nanometers: A (0,0); B (xB,10); C (xC,0). Thus, by sections it is necessary to determine only co-ordinates xB and xC.
Angle of a cone opening at the edge top for i section:
.
Average angle of a cone opening at the edge top:
β= ∑iβi .
5
Error in determination of the angle of a cone opening at the edge top:
Sβ= ∑i(β-βi)2 .
4
Calculation of the radius of curvature of the probe edge
Since the form of the edge is approximated by the sphere surface in different ways, traditionally the curvature radius is calculated at the height of 10 nm from the top of the edge. For this purpose an isoline is constructed at the height of 10 nm from the top (Fig.9). The program calculates automatically the length of the line and area of the surface. For calculation of the curvature radius of the edge (R) we use the value of the isoline length (L): R = L / (2π).
ITo find of an error in determination of a radius we use the results of calculation of the angle of the cone opening at the edge top of a probe, because values xC are dimeters of the probe, measured at the height of 10 nm from the edge top. The error in determination of the curvature radius
will be:
SR=∑i(R – xC i /2)2 .
5
The proposed algorithm for calculation of the form of a probe edge will allow us to restore completely its form only in the event, if the objects used for calibration are in the form of warp-free needles with a vanishing diameter. Since analogues of such objects do not exist, it was proposed to use for calibration TMV particles with cylindrical form and section radius of 8±0.85 nm. Thus, the data obtained with needles of a smaller curvature edge radius may be incorrect.
In calculation of the angle of a cone opening at the edge top of a probe for determination of calibration errors it was proposed to do measurements of 5 sections going through the top of the probe edge and turned by 36о in relation to each other. The variety of values of the angles is explained by measurement errors and possible asymmetric form of the edge.
In calculation of the edge curvature radius for determination of the calibration errors it was proposed to measure a root-mean-square deviation of the probe radius calculated by the length of the isoline, from the radiuses measured by sections, going through the top of the edge and turned by 36о in relation to each other. Then the root-mean-square deviation will be determined by the error of measurement of the probe radius and asymmetry of the edge form.
Since in most cases the probes for AFM are made from crystalline materials, their edge, as a rule, should have faceting, the form of which can be influenced by appearance of an oxide layer due to their storage in the air. If we assume, that the edge has a section in the form of an angle, it is impossible to approximate the section of the tip of the probe by a circle, without setting of a characteristic scale, because it is possible to inscribe a circle of any radius into an angle. Since АFМ is mainly used for the analysis of nano-objects, it was proposed to select as such a scale the height of 10 nanometers from the top of the edge.
Parameters of the probe tops determined by their calculated images can be measured by the images with the help of an electronic microscope. In our work for these purposes Hitachi S-520 microscope was used. Typical images of probes are shown in Fig.10. It is visible that in the process of operation various particles can join the probe edge from the surface of the sample. The images also show that probes have facets.
An example of determination of the parameters of a probe by the images obtained with an electronic microscope is shown in Fig.11. The achieved spatial resolution is obviously not enough for an accurate measurement of the parameters of an edge at the height of 10 nm from the probe top. The size of a pixel is ~5 nm. If we measure the convergence angle of a cone at the edge top, in the image with a low increase, for standard probes it is ~42o (Fig.11а). However in the images it is visible, that there is no acute angle near the edge.
Estimated measurements by the images obtained with an electronic microscope show that a typical angle of a cone opening at the edge top is ~ 130o. Estimation of the curvature radius at the height of 10 nm from edge top gives ~ 50 nm. If we compare the given values with the ones received by the method using numerical calculation of the form of a probe by an AFM image, it is possible to conclude, that the angle of the cone opening at the top of the probe edge and a curvature radius are lower, than in case of determination of the given parameters by the images of the electronic microscopy.
Possibly, this is connected with an insufficient resolution of the images obtained by means of an electronic microscope, resulting in smoothing of the details of a probe edge, which can contribute greatly to AFM images.
Authors express their gratitude for support of their work to the Fund of Infrastructural and Educational Programs of ROSNANO.
На рис.1 приведены топограммы поверхностей кремния и сапфира, на которые нанесены наночастицы, не очень удобные для зондовой микроскопии, поскольку вследствие округлой формы имеют меньшую адгезию к поверхности, чем цилиндрические или прямоугольные. На рис.2 представлена гистограмма распределения наночастиц по размерам.
Наночастицы не имеют строго одинакового размера, однако сила их взаимодействия с поверхностью сравнима с силой воздействия зонда на эти частицы, что затрудняет их измерение методами зондовой микроскопии и приводит к искажению наблюдаемых размеров. Измеряемые латеральные размеры наночастиц существенно отличаются от вертикальных и варьируются вследствие уширения зондом.
Удачными нанообъектами являются структуры живой природы – нуклеиновые кислоты, белки, вирусы, липидные слои, липосомы, фрагменты клеток, но и здесь могут возникать проблемы. Так, по данным электронной микроскопии, двухцепочечная ДНК имеет диаметр в 2,0 нм, однако наблюдаемые в АСМ ее размеры могут широко варьироваться: для подложек слюды и высокоориентированного пиролитического графита с модификатором поверхности высота находиться в диапазоне 0,5–1,5 нм, ширина изменяется от десятков до сотен нанометров.
Измеряемые высота и ширина молекул ДНК зависят от условий наблюдения – влажности воздуха, используемой подложки. При меньшей влажности ее высота и ширина меньше. В результате наличия перечисленных артефактов молекулы ДНК не следует использовать в качестве калибровочных объектов для атомно-силовой микроскопии.
Белки обладают сложной пространственной структурой и собираются в наночастицы, не имеющие примитивной геометрии, например, вид шаров. При осаждении из-за различной ориентации белковых молекул на поверхности подложки их наблюдаемые высота и ширина будут различаться.
Наилучшие объекты для определения пространственного разрешения – природные наночастицы с выраженной симметрией. К ним относятся вирусные частицы, имеющие форму икосаэдра или протяженного цилиндра. Именно протяженные вирусные частицы с круговым поперечным сечением – наиболее удачны для калибровки. При этом среди вирусов целесообразнее выбирать частицы с наибольшей жесткостью. Также следует использовать растительные вирусы, так как они не представляют опасности для человека.
Для работы был выбран вирус табачной мозаики (ВТМ) по следующим причинам:
он обладает большей механической жесткостью среди других доступных вирусов –картофеля А и Х, семилатентного мятлика;
поперечный диаметр вируса лежит в диапазоне 10–20 нм, его длина – 300 нм. Вирус такой продолговатой формы легко отличить на подложке от других объектов, которые могут присутствовать в исходном растворе – примесей и чужеродных частиц;
ВТМ – наиболее распространенный объект вирусологических исследований, его выделение из зараженных растений отработано в полной мере;
это недорогой и доступный биологический препарат.
Наилучшим нанообъектом с известным динамическим размером можно считать меру перемещений – измерительную меры латерального перемещения на основе пьезокерамической пластины [1]. Она в состоянии обеспечить воспроизводимое перемещение длиной в 1 нм с точностью на уровне сотых долей нанометра.
В атомно-силовой микроскопии можно выделить два режима сканирования: контактный и резонансный. Они используются для исследования топографии поверхности. Геометрические параметры острия зонда оказывают значительное влияние на передачу формы объектов, поэтому важна калибровка параметров зонда.
В контактном режиме ключевые параметры: сила воздействия зонда на поверхность, скорость сканирования, обратная связь. Сила выбирается таким образом, чтобы нанообъекты, использующиеся для калибровки параметров зонда, не разрушались. На воспроизведение формы объектов значительно влияет подбор параметров работы обратной связи, оптимальные значения которых зависят, в том числе, и от скорости сканирования. Их настройка должна быть выполнена в соответствии с инструкцией по эксплуатации используемой модели АСМ.
В резонансном режиме сканирования ключевые параметры: амплитуды колебаний зонда (свободных и у поверхности образца), частота колебаний, скорость сканирования, настройка обратной связи. Первые два параметра выбираются так, чтобы исключить разрушение образца при сканировании. Остальные параметры устанавливаются в соответствии с инструкцией по эксплуатации микроскопа.
Важный момент – выбор размера используемых изображений. В зондовой микроскопии используется разрешение 512×512 точек. Чем меньше размер кадра, тем больше точек приходится на профиль нанообъекта. Однако при большем размере кадра в поле зрения попадает большее количество нанообъектов. В случае использования ВТМ это важно, так как наночастица вируса имеет форму цилиндра. Для корректной калибровки зонда АСМ вирусная частица должна попасть полностью в кадр, размер которого должен превышать 210 нм. Частицы ВТМ склонны к агрегации, что проявляется в стыковке вирусных частиц и их преимущественной ориентации по оси цилиндра. С учетом отмеченных особенностей, может быть рекомендован размер кадра в 1000 нм (рис.3). Диаметр вирусной частицы составляет 49,8 нм. Разрешение изображения 0,512 точек/нм. На профиль одной вирусной частицы приходится 25 точек.
Для описания численного алгоритма восстановления формы зонда необходимо дать определение операциям расширение и эрозия. Расширение, примененное к объекту А со структурным элементом B, приводит к увеличению объема объекта, которое контролируется размерами и формой элемента:
A⊕B= ⋃(A+b).
b∈B
Эрозия объекта А со структурным элементом B приводит к обратному эффекту – уменьшению объема объекта, контролируемого размерами и формой элемента:
AB=⋂(A–b).
b∈B
Тенью поверхности s(x, y) называются все точки множества
S = {(x, y, z) | z ≤ s (x, y)}.
Если считать, что положение кончика острия зонда в каждой точке определяет профиль АСМ-изображения, то его можно получить из выражения: I=S⊕(-T), где I – тень поверхности изображения, S – тень поверхности образца, -T – тень инвертированной поверхности зонда относительно центра координат (вершины острия зонда).
Известны два наиболее популярных алгоритма восстановления формы острия зонда по отснятому изображению [2, 3]:
неразрушающее поверхность острие (Non-distortion tip);
слепая аппроксимация острия (Blind tip estimation).
Алгоритм неразрушающего
поверхность острия
Он предполагает, что в каждой точке кончик острия зонда касается поверхности образца, а АСМ-изображение описывает эту поверхность без искажений ее формы. Зонд (Tnd) задается формулой:
Tnd=–(II).
Формула устанавливает предел сверху для формы зонда, так как более тупыми зондами, чем Tnd получить АСМ-изображение для заданной поверхности образца невозможно.
Алгоритм слепой аппроксимации острия
Он предполагает, что в ряде точек зонд касается поверхности боковыми частями острия, а не кончиком. Таким образом, в этих точках АСМ-изображение не отражает истинную поверхность образца. Данный алгоритм построен на итерационной схеме:
-Ti+1=⋂x∈I[(I-x)⊕Pi’ (x)]∩(-Ti),
где Pi’ (x) определяется выражениями:
Pi’ (x)={d|d∈Pi и 0∈I-x+d},
где d – вектор, соединяющий вершину острия инвертированного зонда с точкой касания его боковой поверхности образца (инвертированный зонд P определяется соотношением
P = -T). Это выражение задает ограничение на точки касания, при которых острие зонда может прокалывать поверхность образца.
Функция расчета параметров зонда сканирующего АСМ была интегрирована в программное обеспечение (ПО) ФемтоСкан Онлайн, версия 1.7. Для расчета формы зонда в меню выбирается Mathematics/Morphologicals filters.
При запуске команды Non-distorting tip рассчитывается максимально тупая форма иглы, которая при сканировании не вносит искажений в изображение или его часть. Считается, что данное изображение – точная копия поверхности, и ищется игла, которая может обеспечить такое сканирование.
Фильтр Blind tip estimation тоже вычисляет максимально тупую форму иглы, с помощью которой можно получить изображение или его часть. Однако в этом случае отсутствует требование неискаженности поверхности; на форму иглы действует ограничение другого рода. Если производится сканирование иглой с некоторым радиусом кривизны, на изображении не появятся выпуклые объекты с большей кривизной. Таким образом, выпуклости на поверхности ограничивают форму иглы. При запуске такого фильтра появляется окошко с индикатором прогресса. В ходе работы фильтра производятся итерации, и ожидается, что результат следующей итерации будет отличаться от предыдущей. Если при очередной итерации изменений в форме иглы не происходит, работа фильтра завершается. Примеры применения функций по расчету формы иглы приведены на рис.4 и 5.
При использовании ВТМ в качестве объекта для аппроксимации острия зонда измерения его размеров можно проводить в одном из двух режимов: контактном или резонансном (теппинг). Для измерений используют кантилевер, параметры острия, которого необходимо установить.
При сканировании образца выбирается минимальная сила в контактном режиме или наименьшее изменение амплитуды колебаний кантилевера в резонансном режиме. Скорость сканирования в контактном режиме должна находиться в диапазоне 1–5 Гц, в резонансном – 0,3–1 Гц. Рекомендуемый размер кадра 1×1 мкм2. На изображении должны быть четко видны частицы ВТМ.
Обработку данных с помощью ПО ФемтоСкан Онлайн можно проводить при проведении измерений и после их окончания (рис.6). Описание этого ПО находится в свободном доступе: www.nanoscopy.net/downloads/FemtoScan/FSOnlineManual_ru.pdf
Полученное изображение ВТМ подвергается следующей обработке:
удаляется средний наклон, рассчитанный по методу наименьших квадратов;
выравниваются строки по высоте;
проводится медианная фильтрация (при наличии единичных шумовых выбросов).
По изображению ВТМ (1×1 мкм2, 512×512 точек) рассчитывается форма острия зонда с использованием функции программного обеспечения mathematics/morphological filters/blind tip estimation. Максимальный размер зонда устанавливается равным 50. По завершении вычислений в программе появляется окно с изображением острия зонда (рис.7).
Расчет угла раствора конуса
при вершине острия
По изображению строятся пять сечений зонда, проходящих через его вершину и повернутых относительно друг друга на 36о. По сечению рассчитываются координаты точек треугольника при вершине зонда (рис.8).
Точки имеют следующие координаты (нм):
А (0,0); B (xB,10); C (xC,0). Таким образом, по сечениям необходимо определить только координаты xB и xC.
Угол раствора конуса при вершине острия для i сечения
.
Средний угол раствора конуса при вершине острия:
β= ∑iβi .
5
Погрешность определения угла раствора конуса при вершине острия:
Sβ= ∑i(β-βi)2 .
4
Расчет радиуса скругления острия зонда
Так как форма острия неоднозначно аппроксимируется поверхностью сферы, принято рассчитывать радиус скругления на высоте 10 нм от вершины острия. Для этого строится изолиния на высоте 10 нм от этой вершины (рис.9). Программа автоматически рассчитывает длину линии и площадь поверхности. Для расчета радиуса скругления острия (R) используется значение длины изолинии (L): R = L / (2π).
Для нахождения погрешности определения радиуса используются результаты, полученные при расчете угла раствора конуса острия зонда, поскольку значения xC являются диметрами зонда, измеренными на высоте 10 нм от вершины острия. Тогда погрешность определения радиуса скругления
SR=∑i(R – xC i /2)2 .
5
Алгоритм расчета формы острия зонда позволит восстановить его форму только в том случае, если для калибровки использованы объекты в виде недеформируемых игл с диаметром, стремящимся к нулю. Поскольку аналогов таких объектов не существует, предложено для калибровки использовать частицы ВТМ цилиндрической формы с радиусом сечения 8±0,85 нм. Для игл с меньшим радиусом скругления острия могут быть получены некорректные данные.
При расчете угла раствора конуса при вершине зонда для определения погрешностей калибровки предложено проводить измерения для пяти сечений, проведенных через вершину острия зонда и повернутых относительно друг друга на 36о. Разброс значений связан с погрешностью измерений и с асимметричной формой острия.
При расчете радиуса скругления для определения погрешностей калибровки предложено измерять среднеквадратичное отклонение радиуса зонда, вычисленного по длине изолинии, от радиусов, измеренных по сечениям, проведенным через вершину острия и повернутым друг к другу на 36о. Среднеквадратичное отклонение будет определяться погрешностью измерения радиуса зонда и асимметрией формы острия.
В большинстве случаев зонды для АСМ делаются из кристаллических материалов. Их острие должно иметь огранку, на форму которой может оказывать влияние появление слоя оксида при хранении изделий на воздухе. Если предположить, что острие имеет сечение в форме угла, то невозможно аппроксимировать сечение кончика зонда окружностью, не задав характерного масштаба, поскольку в угол можно вписать окружность любого радиуса. Так как АСМ преимущественно используется для анализа нанобъектов, предложено в качестве такого масштаба выбрать высоту в 10 нм от вершины острия.
Параметры острий зондов, определяемые по рассчитанным их изображениям, могут быть измерены по изображениям с помощью электронного микроскопа. Для этих целей в работе использовался микроскоп Hitachi S-520. Типичные изображения зондов показаны на рис.10. Видно, что в процессе эксплуатации к острию зонда могут присоединяться различные частицы с поверхности образца. Изображения также показывают, что зонды имеют огранку.
Пример определения параметров зонда по изображениям, полученным на электронном микроскопе, показан на рис.11. Достигнутого пространственного разрешения явно недостаточно для точного измерения параметров острия на высоте 10 нм от вершины зонда. Размер пикселя ~5 нм. Если измерять угол сходимости конуса при вершине острия на изображении с низким увеличением, для стандартных зондов он составил ~42o (рис.11а). На изображениях видно, что вблизи острия отсутствует острый угол. Оценочные измерения по изображениям, полученным на электронном микроскопе, показывают, что типичный угол раствора конуса при вершине острия ~130o. Оценка радиуса скругления на высоте 10 нм от вершины острия дает ~50 нм. Если сравнить данные с полученными по методике, использующей численный расчет формы зонда по АСМ-изображению, можно заключить, что угол раствора конуса при вершине острия зонда и радиус скругления ниже, чем в случае определения параметров по изображениям электронной микроскопии. Это связано с недостаточным разрешением изображений, полученных с помощью электронного микроскопа, что приводит к сглаживанию деталей острия зонда, которые могут вносить значительный вклад в АСМ-изображения.
Авторы выражают благодарность за поддержку работы Фонду инфраструктурных и образовательных программ РОСНАНО.
Литература
Мешков Г., Синицына О., Яминский Д., Яминский И. Динамическая измерительная мера "Нанометр". – Наноиндустрия, 2012, №6, с.40–43.
Villarrubia J.S. Morphological estimation of tip geometry for scanned probe microscopy. – Surface Science, 1994, v.321, р.287–300.
Villarrubia J.S. Algorithms for Scanned Probe Microscope Image Simulation, Surface Reconstruction, and Tip Estimation. – J. Res. Natl. Inst. Stand. Technol, 1997, v.102, р.425–454.
Artificial inorganic nanoparticles practically always have a variety of geometrical parameters. Their synthesis is usually determined by the physical laws and used chemical processes. However, usually the accuracy and reproducibility of the particles’ sizes can hardly be controlled. Besides, when fixed on a substrate, due to the influence of the surface forces on the boundary of separation of phases, which, because of a nano-meter scale, can influence an object considerably, their sizes may change.
Fig.1 presents topograms of silicon and sapphire surfaces with nanoparticles on them, which are not so convenient for a probe microscopy because of their roundish forms, less adhesive to the surfaces, than the cylindrical or rectangular forms. Fig.2 presents a histogram of distribution of the nanoparticles by their sizes.
Nanoparticles do not have a strictly identical size, however the force of their interaction with a surface is comparable with the force of influence of a probe on such particles, which complicates their measurement by the methods of probe microscopy and leads to distortion of the observable sizes. The measured lateral sizes of nanopaticles differ essentially from the vertical ones and vary owing to their widening by a probe.
Convenient nano-objects are wildlife structures – nucleic acids, proteins, viruses, lipide layers, liposomes and fragments of cells, but here, too, problems may arise. So, according to the electronic microscopy, a two-chained DNA has a diameter of 2.0 nm, however, its sizes observed in АFМ can vary widely:
For substrates of mica and highly-orientated pyrolitic graphite with a surface modifier its height is within the range of 0.5–1.5 nm,
Its width varies from tens up to hundreds of nanometers.
The measured height and width of DNA molecules depend on the observation conditions – humidity of air and the used substrate. With lower humidity its height and width are less. Because of the above listed facts a DNA molecule should not be used as a calibration sample in the atomic-force microscopy.
Proteins have a complex spatial structure and gather into nanoparticles without a primitive geometry, for example, a kind of spheres. As a result of sedimentation due to various orientations of the protein molecules on a substrate surface their observed height and width will differ.
The best objects for determination of a spatial resolution are natural nanoparticles with a pronounced symmetry. Among them are virus particles, which have a form of an icosahedron or a lengthy cylinder. Exactly the lengthy virus particles with circular cross-section are the most convenient for calibration. At that among viruses it would be more expedient to select particles with the greatest rigidity. It is also recommended to use vegetative viruses, since they are not hazardous for people.
For this work the tobacco mosaic virus (TMV) was selected due to the following reasons:
It has the greatest mechanical rigidity among the other available viruses – of A and X potatoes and semilatent meadow grass;
The cross-section diameter of the virus is within the range of 10–20 nm, its length is 300 nm. The virus of such an oblong form is easy to distinguish on a substrate from the other objects, which can be present in an initial solution – impurities and alien particles;
TMV is the most widespread object in virological researches, the technology of its isolation from the infected plants is well-known;
It is an inexpensive and accessible biological preparation.
The best nano-object with a known dynamic size can be considered a movement measure –measure of a lateral movement based on a piezoceramic plate [1]. It can ensure a reproducible movement of one nanometer length with the accuracy at the level of 100-th shares of a nanometer.
In the atomic-force microscopy it is possible to single out two modes of scanning: contact and resonance ones. They are used for research of a surface topography. The geometrical parameters of the edge of a probe has a considerable impact on the vision of the objects’ form, therefore, calibration of the probe parameters is very important.
The key parameters in the contact mode are the force of influence of a probe on a surface, speed of scanning, feedback. The force is selected in a way not damaging the nano-objects used for calibration of the probe parameters. The reproduction of the objects’ form is influenced considerably by selection of the feedback operation parameters, the optimum values of which depend, among other things, on the speed of scanning. Their adjustment should be done in accordance with the operating instruction of the used АFМ model.
The key parameters in the resonance mode are amplitude of the probe vibrations (of the free ones and of the ones on the sample’s surface), frequency of vibrations, speed of scanning, and adjustment of the feedback. The first two parameters are selected to exclude destruction of a sample during scanning. The other parameters are established in accordance with the microscope operating instruction.
An important point is selection of the size of the used images. In probe microscopy the resolution of 512 х 512 points is used. The smaller is the size of a frame, the more points are in the profile of a nano-object. However, with a bigger size of a frame, more nano-objects are in sight. When TMV is used, this is important, since a nonoparticle of the virus has a cylinder form.
For an accurate calibration of an AFM probe a virus particle should be fully placed within the frame, the size of which must exceed 210 nm. TMV particles are prone to aggregation, which becomes apparent in their link-up and preferential orientation along the cylinder axis. Taking into account the above features, we would recommend the size of a frame of 1000 nm. (Fig.3). Diameter of a virus particle equals to 49.8 nm. The image resolution is 0.512 points/nm. There are 25 points per one virus particle profile.
In order to describe the numerical algorithm of restoration of a probe form we should make definitions of the operations of expansion and erosion. Expansion applied to object A with a structural element B leads to an increase of the volume of the object, which is controlled by the element’s sizes and form:
A⊕B= ⋃(A+b).
b∈B
Erosion of object A with a structural element B leads to a boomerang effect – to reduction of the volume of the object controlled by the size and the form of an element:
AB=⋂(A–b).
b∈B
The surface’s shadow s(x, y) is comprised of all the points of the set
S = {(x, y, z) | z ≤ s (x, y)}.
If we assume that the position of the probe edge in each point determines the profile of an AFM image, it can be obtained from the expression I=S⊕(-T), where I is the shadow of the image surface, S is the shadow of the sample’s surface, T is the shadow of the probe’s surface inverted in relation to the coordinate center (top of the probe edge).
Two most popular algorithms for restoration of the form of a probe tip by the filmed image [2, 3] are known:
Non-distortion tip (tip not destroying a surface);
Blind tip estimation (blind approximation of a tip).
Algorithm of the non-distortion tip
It assumes that in each point the tip of a probe edge touches the surface of a sample, while the AFM image describes this surface without distortion of its form. Probe (Tnd) is set by the formula:
Tnd=–(II).
The formula establishes the upper limit for the probe form, because it is impossible to obtain an AFM image for the set surface of the sample with more blunt probes than Tnd.
Algorithm of blind tip estimation
It assumes that in a number of points a probe touches the surface with the lateral parts of its edge, instead of its tip. Thus, in these points an AFM image does not reflect the true surface of the sample. The given algorithm is constructed on an iterative pattern:
-Ti+1=⋂x∈I[(I-x)⊕Pi’ (x)]∩(-Ti),
where Pi’ (x) is determined by the expression:
Pi’ (x)={d|d∈Pi и 0∈I-x+d},
where d – is the vector connecting the tip of the edge of the inverted probe with the contact point of its lateral surface of the sample (inverted probe P is determined by the parity P = -T). This expression sets restriction on the contact points, in case of which the probe edge can pierce the surface of a sample.
The function of calculation of the probe parameters of a scanning AFM was integrated into the software FemtoScan Online, version 1.7. For calculation of a probe form select Mathematics/Morphologicals filters in the menu.
When you start Non-distorting tip command, the maximally blunt form of a needle will be calculated, which does not cause distortions in the image or its parts during scanning. It is believed that the given image is an exact copy of the surface, and a respective needle is sought, which can ensure such scanning.
Blind tip estimation filter, too, calculates the maximally blunt form of a needle, with the help of which it is possible to obtain an image or its part. However in this case there is no requirement for nondistorted surfaces; the needle form is effected by restrictions of other sorts. If a scanning is done by a needle with a certain curvature radius, in the image there will be no convex objects with bigger curvature.
Thus, cambers on a surface restrict the needle’s form. When such a filter started, a window appears with the progress indicator. During the filter operation iterations are done, and it is expected, that the result of the following iteration will differ from the previous one. If another iteration brings no changes to the needle form, the filter terminates its operation. Examples of application of the functions for calculation of the form of a needle are presented in Fig.4 and Fig.5.
When TMV is used as an object for approximation of the edge of a probe, measurement of its size can be done in one of the two modes: contact mode or resonance (tapping) mode. For measurements a cantilever is used, the parameters of the edge of which should be established.
During scanning of a sample the minimum force is selected in a contact mode or the minimal change of the fluctuation amplitude of the cantilever in a resonant mode. The speed of scanning in the contact mode should be within the range of 1–5 Hz, and in the resonance mode – 0.3–1 Hz. The recommended size of the frame is 1х1 micrometer2. The TMV particles should be distinctly visible in the image.
Data processing with the help of FemtoScan Online software can be done during the process of measuring and after its termination (Fig.6). The description of this software is available in a free access: www.nanoscopy.net/downloads/FemtoScan/FSOnlineManual_ru.pdf
The obtained TMV image is processed in the following way:
– Average inclination calculated by the method of the minimal squares is removed;
– Lines are aligned by height;
– Median filtration is done (if individual noise emissions are present).
By TMV image (1×1 mcr2, 512×512 points) the form of a probe edge is calculated with the use of a function of the software mathematics/morphologicalfilters/blindtip estimation. The maximal size of a probe is established as equal to 50. When calculations are finished, a window appears in the program with the image of the probe edge (Fig.7).
Calculation of the angle of a cone
opening at the edge top
By the image five sections of the probe are constructed, passing through its top and turned by 36о in relation to each other. By the section the co-ordinate points of a triangle at the probe top are calculated (Fig.8)
The points have the following co-ordinates in nanometers: A (0,0); B (xB,10); C (xC,0). Thus, by sections it is necessary to determine only co-ordinates xB and xC.
Angle of a cone opening at the edge top for i section:
.
Average angle of a cone opening at the edge top:
β= ∑iβi .
5
Error in determination of the angle of a cone opening at the edge top:
Sβ= ∑i(β-βi)2 .
4
Calculation of the radius of curvature of the probe edge
Since the form of the edge is approximated by the sphere surface in different ways, traditionally the curvature radius is calculated at the height of 10 nm from the top of the edge. For this purpose an isoline is constructed at the height of 10 nm from the top (Fig.9). The program calculates automatically the length of the line and area of the surface. For calculation of the curvature radius of the edge (R) we use the value of the isoline length (L): R = L / (2π).
ITo find of an error in determination of a radius we use the results of calculation of the angle of the cone opening at the edge top of a probe, because values xC are dimeters of the probe, measured at the height of 10 nm from the edge top. The error in determination of the curvature radius
will be:
SR=∑i(R – xC i /2)2 .
5
The proposed algorithm for calculation of the form of a probe edge will allow us to restore completely its form only in the event, if the objects used for calibration are in the form of warp-free needles with a vanishing diameter. Since analogues of such objects do not exist, it was proposed to use for calibration TMV particles with cylindrical form and section radius of 8±0.85 nm. Thus, the data obtained with needles of a smaller curvature edge radius may be incorrect.
In calculation of the angle of a cone opening at the edge top of a probe for determination of calibration errors it was proposed to do measurements of 5 sections going through the top of the probe edge and turned by 36о in relation to each other. The variety of values of the angles is explained by measurement errors and possible asymmetric form of the edge.
In calculation of the edge curvature radius for determination of the calibration errors it was proposed to measure a root-mean-square deviation of the probe radius calculated by the length of the isoline, from the radiuses measured by sections, going through the top of the edge and turned by 36о in relation to each other. Then the root-mean-square deviation will be determined by the error of measurement of the probe radius and asymmetry of the edge form.
Since in most cases the probes for AFM are made from crystalline materials, their edge, as a rule, should have faceting, the form of which can be influenced by appearance of an oxide layer due to their storage in the air. If we assume, that the edge has a section in the form of an angle, it is impossible to approximate the section of the tip of the probe by a circle, without setting of a characteristic scale, because it is possible to inscribe a circle of any radius into an angle. Since АFМ is mainly used for the analysis of nano-objects, it was proposed to select as such a scale the height of 10 nanometers from the top of the edge.
Parameters of the probe tops determined by their calculated images can be measured by the images with the help of an electronic microscope. In our work for these purposes Hitachi S-520 microscope was used. Typical images of probes are shown in Fig.10. It is visible that in the process of operation various particles can join the probe edge from the surface of the sample. The images also show that probes have facets.
An example of determination of the parameters of a probe by the images obtained with an electronic microscope is shown in Fig.11. The achieved spatial resolution is obviously not enough for an accurate measurement of the parameters of an edge at the height of 10 nm from the probe top. The size of a pixel is ~5 nm. If we measure the convergence angle of a cone at the edge top, in the image with a low increase, for standard probes it is ~42o (Fig.11а). However in the images it is visible, that there is no acute angle near the edge.
Estimated measurements by the images obtained with an electronic microscope show that a typical angle of a cone opening at the edge top is ~ 130o. Estimation of the curvature radius at the height of 10 nm from edge top gives ~ 50 nm. If we compare the given values with the ones received by the method using numerical calculation of the form of a probe by an AFM image, it is possible to conclude, that the angle of the cone opening at the top of the probe edge and a curvature radius are lower, than in case of determination of the given parameters by the images of the electronic microscopy.
Possibly, this is connected with an insufficient resolution of the images obtained by means of an electronic microscope, resulting in smoothing of the details of a probe edge, which can contribute greatly to AFM images.
Authors express their gratitude for support of their work to the Fund of Infrastructural and Educational Programs of ROSNANO.
Отзывы читателей
