eng
Выпуск #7/2013
Т.Зимина, В.Лучинин
"Лаборатория на чипе". Микробиологическая экспресс-диагностика патогенных бактерий
"Лаборатория на чипе". Микробиологическая экспресс-диагностика патогенных бактерий
Просмотры: 3657
Микробиологическая экспресс-диагностика актуальна в связи с ростом числа бактериальных инфекций. В настоящей статье представлены базовые принципы и предложения по созданию автоматических портативных устройств микробиологической экспресс-диагностики, которые обеспечивают выращивание, анализ и оценку антибиотикорезистентности колоний патогенных бактерий. Подобные системы создают предпосылки к успешной борьбе с распространением устойчивых штаммов бактерий, определению их вида и выбору эффективной терапии.
Теги: microbiological analysis pathogenic bacteria portable diagnostic systems микробиологический анализ патогенные бактерии портативные диагностические системы
Анализ бактериальных инфекций, как правило, занимает нескольких суток, что не всегда приемлемо и диктует необходимость разработки новых методов оперативной диагностики. Перспективной является реализация "лабораторий на чипе" в составе портативных аналитико-диагностических систем, позволяющих ускорить анализ в десятки раз, т.е. уменьшить его продолжительность до 6–8 ч. Такие портативные системы должны функционировать как в лабораторных, так и в полевых условиях и интегрироваться в рамках современных инфокоммуникационных систем. "Лаборатории на чипе" должны легко перенастраиваться для работы с различным клиническим материалом, обеспечивать возможность оценки бактериальной обсемененности внешней среды и осуществлять поиск возбудителей различных инфекций: респираторных, желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта, внутрибольничных и др.
В настоящей статье представлены базовые принципы и предложения по созданию миниатюрных систем микробиологической экспресс-диагностики, которые обеспечивают выращивание, анализ и оценку антибиотикорезистентности колоний патогенных бактерий. Фактически девизом может стать положение: "От чашки Петри к наноматрицам пористого анодного оксида алюминия".
Проблемы микробиологической экспресс-диагностики
Анализ микробиологических проб включает изоляцию микробных клеток, накопление биомассы и идентификацию штаммов таких клеток, определение их количества и чувствительности к антибиотикам. Это необходимо для диагностики инфекционных заболеваний и назначения антибактериальной терапии. Проблема особенно актуальна в связи с ростом заболеваемости населения инфекционными бактериальными заболеваниями и увеличением числа устойчивых штаммов патогенных бактерий. Традиционное микробиологическое исследование трудоемко, длительно (2–7 дней) и может проводиться только в специализированных учреждениях.
Работы по созданию экспрессных методов микробиологического анализа ведутся в целом ряде лабораторий. Известны автоматические и полуавтоматические инструментальные способы микробиологического анализа, реализуемые с помощью стационарных приборов, однако они продолжительны и требуют первичного накопления клеток. Сравнение характеристик промышленных приборов и описанных в настоящей статье устройств приведено в таблице.
Наиболее длительной стадией культурального микробиологического анализа является выращивание микроорганизмов на питательных средах. Именно этот этап требует усовершенствования для повышения скорости анализа. Длительность его определяется необходимостью накопления видимых колоний с явными характеристиками (рис.1). После первичного инкубирования и накопления материал вручную отбирается для дальнейших исследований, включающих идентификацию, выделение и накопление чистой культуры патогена, а также постановку теста на чувствительность к антибиотикам.
Известен полуавтоматический метод микробиологического анализа (колонка 2 таблицы), в котором используется посев биологических образцов в чашки Петри с питательной средой, инкубация проб для накопления колоний микробных клеток, выделение отдельных колоний и исследование их чувствительности к антибиотикам по методу Кирби–Баера. Многие операции проводятся вручную, что существенно снижает скорость процесса. Применяемый инкубатор имеет высокую стоимость и большие габариты, поэтому метод принципиально не подходит для работы вне крупных лабораторий. Кроме того, данный метод фактически непригоден для автоматизации и требует значительного количества расходных материалов.
Микробиологический анализатор VITEK 2 Com-
pact 60 французской фирмы bioMérieux (колонка 3 таблицы) проводит автоматическую идентификацию патогенных микробных клеток и определение их чувствительности к антибиотикам на отдельных микробиологических карточках для каждого типа анализов. Для работы требуется предварительное накопление и выделение штамма патогенной бактерии. Время анализа составляет, по данным производителя оборудования, до одних суток, а с учетом предварительного накопления патогенных микробных клеток занимает двое и более суток. Этот стационарный и дорогостоящий прибор предназначен в первую очередь для крупных централизованных микробиологических лабораторий. В приборе не автоматизированы предварительное накопление и сортировка микробных клеток с выделением патогенных или диагностически значимых штаммов. Таким образом, этот прибор не позволяет решать поставленные выше задачи.
Достижения нано- и микротехнологий и миниатюризация в инструментальном анализе открыли возможности создания нового поколения микро-
аналитических систем "лаборатории на чипе" (lab-on-a-chip), представляющих собой миниатюрные гибридные устройства, изготовляемые с помощью 2D- и 3D-технологий. Разработка таких систем позволяет снизить материало- и энергоемкость изделий, их стоимость, повысить производительность анализа. Микро- и нанотехнологии обеспечивают прецизионное формообразование и геометрическую комплементарность компонентов на молекулярном уровне, повышение без дополнительных затрат скорости
анализа, а также управление массопереносом и автоматическое регулирование в микромасштабе
стадий анализа в интегрированных функциональных модулях и подсистемах. Перенос биологических объектов может осуществляться с помощью проточного анализа с использованием микрофлюидики.
При современном методе культивирования и анализа индивидуальных культур клеток, после предварительной очистки пробы они помещаются в ростовые ячейки для одновременного роста при заданных условиях (влажность, температура, состав жидкой среды) с получением индивидуальных микроколоний. Метод реализуется с применением ячеек очень малого размера, сформированных с помощью микротехнологий, чтобы обеспечить рост индивидуальных клеток, размер которых сопоставим с размером ростовой зоны. Суспензия клеток помещается в ростовые зоны после разделения на отдельные достаточно малые объемы для обеспечения роста гомогенной культуры в каждом объеме. После этого проводится их посев и инкубирование в отдельных микролунках, имеющих цилиндрическую форму и отделенных друг от друга расстоянием не менее 1,8 мм. Общая для всех индивидуальных микроколоний поверхность между микролунками имеет водоотталкивающее покрытие. Во время инкубирования к культурам поступают необходимые питательные вещества через мембраны с размером пор от десятков нанометров до единиц микрон. Однако в данном способе не решена задача быстрого отделения индивидуальных микроколоний и их переноса во внешние устройства идентификации и сортировки.
Метод сложен и не приспособлен для экспресс-
анализа, а соответствующее устройство не может использоваться в портативном приборе из-за сложной конструкции и низкой прочности дозаторов. Конструкция не предусматривает выделение и идентификацию патогенных штаммов с целью их накопления и исследования чувствительности к антибактериальным препаратам.
Наиболее перспективным представляется метод с использованием пластины из пористого анодного оксида алюминия, на поверхности которой сформированы зоны для роста микроорганизмов. Эти зоны ограничены стенками полимерной сетки, которая образована ламинированием с последующей фотолитографией и плазменным травлением. Питательный раствор просачивается за счет капиллярных сил через поры сопряженной со слоем агар-агара пластины из пористого анодного оксида алюминия. Далее микробные клетки подаются вручную и распределяются по зонам роста. Инкубация проводится при 37°С или иных заданных анаэробных условиях при наблюдении за ростом колоний с помощью микроскопа. После достижения достаточного размера, колонии микробных клеток отсоединяются от зон роста и вручную переносятся во внешние средства идентификации. Основные недостатки метода – ручное выполнение операций подачи клеток в зоны роста, "отсоединения" выросших колоний и их переноса в средства идентификации.
микроаналитическиЕ приборЫ на основе пористого анодного оксида алюминия
Рассмотрим конструкцию портативного анализатора (рис.2а) и предложенный для "лаборатории на чипе" метод выращивания колоний микробных клеток, который позволяет создать условия для выращивания, отрыва и переноса микроколоний. Для его осуществления использовался пористый анодный оксид алюминия.
Чип (рис.2b) для микробиологического экспресс-анализа имеет следующие конструктивно-технологические особенности:
• подача питательного раствора в зоны роста колоний микробных клеток выполняется снизу вверх за счет перепада давления через отверстия в пластине и пористые мембраны (рис.3). Такое решение позволяет контролировать величину подачи, а также автоматизировать процесс (например, используя насос);
• суспензия микробных клеток автоматически насосом подается на верхнюю поверхность пластины и равномерно распределяется в зонах роста;
• условия для роста микроорганизмов в виде колоний создаются при жестком контроле параметров среды (температуры, влажности, парциального давления кислорода);
• выполняется постоянное наблюдение за ростом колоний;
• гидрофобная пленка на поверхности пластины с отверстиями препятствует прикреплению к ней микроорганизмов, которые будут задерживаться зонами роста с повышенной концентрацией подаваемых снизу питательных веществ;
• при достижении размера 100–1000 клеток микроколонии без механических повреждений отрываются от зон роста гидроударом и в потоке переносятся во внешние средства идентификации. Используемые режимы позволяют автоматизировать отрыв колоний для их последующего переноса.
Предлагаемый способ обеспечивает соизмеримость зон роста и микроколоний, предполагая выделение чистой культуры микроорганизмов. Контроль подачи питательной среды сочетается с контролем роста колоний in situ.
Образование зон роста в отверстиях пористой пластины размещением в них мембран и нанесением покрытия позволяет быстро выращивать колонии без ограничения этих зон. Мембраны играют роль барьеров, задерживающих клетки в зонах роста после подачи суспензии. Отверстия в пластине выполнены в виде цилиндров с гладкими стенками ортогонально большой плоскости пористой пластины и топологически кодированы, что позволяет усовершенствовать манипулирование колониями и наблюдение за их ростом. Топологическое кодирование отверстий упрощает наблюдение посредством цифровой видеокамеры. Цилиндрическая форма отверстий и их ортогональное расположение обеспечивают снижение энергетических затрат для отрыва колоний при гидроударе. Отверстия исполнены в виде сопел, определяющих скорость потока и его однородность. Возможно регулирование размера сопла и конфигурации мембраны, поддерживающей колонии микроорганизмов. Размер пор мембраны, не пропускающих микробные клетки, обеспечивает стерильность нижней емкости, что обуславливает одноразовое использование устройства.
Таким образом, описанное миниатюрное устройство обеспечивает автоматизацию подачи питательного раствора, отделения и переноса колоний бактерий.
МОБИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ
Итак, авторами предложены конструкция микро-
аналитического прибора и способ выращивания колоний микробных клеток, которые имеют следующие особенности:
• подача питательного раствора снизу вверх через пористую пластину из анодного оксида алюминия в сформированные на ее верхней поверхности зоны роста колоний клеток;
• подача микробных клеток на верхнюю поверхность пористой пластины из анодного оксида алюминия;
• создание контролируемых условий роста колоний;
• наблюдение за ростом колоний;
• отсоединение колоний микробных клеток от зон роста и перенос их во внешние средства идентификации.
Способ реализован в устройстве, содержащем пористую пластину из анодного оксида алюминия со сформированными на ее верхней поверхности зонами роста колоний. Нижняя поверхность пластины сопряжена с устройством для выращивания колоний микробных клеток при подаче питательного раствора. Мембраны изготовлены из анодного оксида алюминия, а крышка верхней емкости снабжена центральным окном с закрепленным в нем оптическим стеклом для наблюдения за ростом колоний.
Создание миниатюрных мобильных устройств для экспресс-идентификации патогенов и определения их чувствительности к антибиотикам с использованием "лаборатории на чипе" позволяет оперативно выбирать тактику лечения инфекционных заболеваний, повысить ее эффективность, децентрализовать микробиологический анализ, сделав его доступным для населения, в том числе удаленных районов. Низкая стоимость и доступность анализа создают предпосылки для повышения оперативности лабораторной диагностики при обнаружении и лечении инфекционных заболеваний.
* С.-Петербургский электротехнический университет им. В.И. Ульянова (Ленина) «ЛЭТИ»
В настоящей статье представлены базовые принципы и предложения по созданию миниатюрных систем микробиологической экспресс-диагностики, которые обеспечивают выращивание, анализ и оценку антибиотикорезистентности колоний патогенных бактерий. Фактически девизом может стать положение: "От чашки Петри к наноматрицам пористого анодного оксида алюминия".
Проблемы микробиологической экспресс-диагностики
Анализ микробиологических проб включает изоляцию микробных клеток, накопление биомассы и идентификацию штаммов таких клеток, определение их количества и чувствительности к антибиотикам. Это необходимо для диагностики инфекционных заболеваний и назначения антибактериальной терапии. Проблема особенно актуальна в связи с ростом заболеваемости населения инфекционными бактериальными заболеваниями и увеличением числа устойчивых штаммов патогенных бактерий. Традиционное микробиологическое исследование трудоемко, длительно (2–7 дней) и может проводиться только в специализированных учреждениях.
Работы по созданию экспрессных методов микробиологического анализа ведутся в целом ряде лабораторий. Известны автоматические и полуавтоматические инструментальные способы микробиологического анализа, реализуемые с помощью стационарных приборов, однако они продолжительны и требуют первичного накопления клеток. Сравнение характеристик промышленных приборов и описанных в настоящей статье устройств приведено в таблице.
Наиболее длительной стадией культурального микробиологического анализа является выращивание микроорганизмов на питательных средах. Именно этот этап требует усовершенствования для повышения скорости анализа. Длительность его определяется необходимостью накопления видимых колоний с явными характеристиками (рис.1). После первичного инкубирования и накопления материал вручную отбирается для дальнейших исследований, включающих идентификацию, выделение и накопление чистой культуры патогена, а также постановку теста на чувствительность к антибиотикам.
Известен полуавтоматический метод микробиологического анализа (колонка 2 таблицы), в котором используется посев биологических образцов в чашки Петри с питательной средой, инкубация проб для накопления колоний микробных клеток, выделение отдельных колоний и исследование их чувствительности к антибиотикам по методу Кирби–Баера. Многие операции проводятся вручную, что существенно снижает скорость процесса. Применяемый инкубатор имеет высокую стоимость и большие габариты, поэтому метод принципиально не подходит для работы вне крупных лабораторий. Кроме того, данный метод фактически непригоден для автоматизации и требует значительного количества расходных материалов.
Микробиологический анализатор VITEK 2 Com-
pact 60 французской фирмы bioMérieux (колонка 3 таблицы) проводит автоматическую идентификацию патогенных микробных клеток и определение их чувствительности к антибиотикам на отдельных микробиологических карточках для каждого типа анализов. Для работы требуется предварительное накопление и выделение штамма патогенной бактерии. Время анализа составляет, по данным производителя оборудования, до одних суток, а с учетом предварительного накопления патогенных микробных клеток занимает двое и более суток. Этот стационарный и дорогостоящий прибор предназначен в первую очередь для крупных централизованных микробиологических лабораторий. В приборе не автоматизированы предварительное накопление и сортировка микробных клеток с выделением патогенных или диагностически значимых штаммов. Таким образом, этот прибор не позволяет решать поставленные выше задачи.
Достижения нано- и микротехнологий и миниатюризация в инструментальном анализе открыли возможности создания нового поколения микро-
аналитических систем "лаборатории на чипе" (lab-on-a-chip), представляющих собой миниатюрные гибридные устройства, изготовляемые с помощью 2D- и 3D-технологий. Разработка таких систем позволяет снизить материало- и энергоемкость изделий, их стоимость, повысить производительность анализа. Микро- и нанотехнологии обеспечивают прецизионное формообразование и геометрическую комплементарность компонентов на молекулярном уровне, повышение без дополнительных затрат скорости
анализа, а также управление массопереносом и автоматическое регулирование в микромасштабе
стадий анализа в интегрированных функциональных модулях и подсистемах. Перенос биологических объектов может осуществляться с помощью проточного анализа с использованием микрофлюидики.
При современном методе культивирования и анализа индивидуальных культур клеток, после предварительной очистки пробы они помещаются в ростовые ячейки для одновременного роста при заданных условиях (влажность, температура, состав жидкой среды) с получением индивидуальных микроколоний. Метод реализуется с применением ячеек очень малого размера, сформированных с помощью микротехнологий, чтобы обеспечить рост индивидуальных клеток, размер которых сопоставим с размером ростовой зоны. Суспензия клеток помещается в ростовые зоны после разделения на отдельные достаточно малые объемы для обеспечения роста гомогенной культуры в каждом объеме. После этого проводится их посев и инкубирование в отдельных микролунках, имеющих цилиндрическую форму и отделенных друг от друга расстоянием не менее 1,8 мм. Общая для всех индивидуальных микроколоний поверхность между микролунками имеет водоотталкивающее покрытие. Во время инкубирования к культурам поступают необходимые питательные вещества через мембраны с размером пор от десятков нанометров до единиц микрон. Однако в данном способе не решена задача быстрого отделения индивидуальных микроколоний и их переноса во внешние устройства идентификации и сортировки.
Метод сложен и не приспособлен для экспресс-
анализа, а соответствующее устройство не может использоваться в портативном приборе из-за сложной конструкции и низкой прочности дозаторов. Конструкция не предусматривает выделение и идентификацию патогенных штаммов с целью их накопления и исследования чувствительности к антибактериальным препаратам.
Наиболее перспективным представляется метод с использованием пластины из пористого анодного оксида алюминия, на поверхности которой сформированы зоны для роста микроорганизмов. Эти зоны ограничены стенками полимерной сетки, которая образована ламинированием с последующей фотолитографией и плазменным травлением. Питательный раствор просачивается за счет капиллярных сил через поры сопряженной со слоем агар-агара пластины из пористого анодного оксида алюминия. Далее микробные клетки подаются вручную и распределяются по зонам роста. Инкубация проводится при 37°С или иных заданных анаэробных условиях при наблюдении за ростом колоний с помощью микроскопа. После достижения достаточного размера, колонии микробных клеток отсоединяются от зон роста и вручную переносятся во внешние средства идентификации. Основные недостатки метода – ручное выполнение операций подачи клеток в зоны роста, "отсоединения" выросших колоний и их переноса в средства идентификации.
микроаналитическиЕ приборЫ на основе пористого анодного оксида алюминия
Рассмотрим конструкцию портативного анализатора (рис.2а) и предложенный для "лаборатории на чипе" метод выращивания колоний микробных клеток, который позволяет создать условия для выращивания, отрыва и переноса микроколоний. Для его осуществления использовался пористый анодный оксид алюминия.
Чип (рис.2b) для микробиологического экспресс-анализа имеет следующие конструктивно-технологические особенности:
• подача питательного раствора в зоны роста колоний микробных клеток выполняется снизу вверх за счет перепада давления через отверстия в пластине и пористые мембраны (рис.3). Такое решение позволяет контролировать величину подачи, а также автоматизировать процесс (например, используя насос);
• суспензия микробных клеток автоматически насосом подается на верхнюю поверхность пластины и равномерно распределяется в зонах роста;
• условия для роста микроорганизмов в виде колоний создаются при жестком контроле параметров среды (температуры, влажности, парциального давления кислорода);
• выполняется постоянное наблюдение за ростом колоний;
• гидрофобная пленка на поверхности пластины с отверстиями препятствует прикреплению к ней микроорганизмов, которые будут задерживаться зонами роста с повышенной концентрацией подаваемых снизу питательных веществ;
• при достижении размера 100–1000 клеток микроколонии без механических повреждений отрываются от зон роста гидроударом и в потоке переносятся во внешние средства идентификации. Используемые режимы позволяют автоматизировать отрыв колоний для их последующего переноса.
Предлагаемый способ обеспечивает соизмеримость зон роста и микроколоний, предполагая выделение чистой культуры микроорганизмов. Контроль подачи питательной среды сочетается с контролем роста колоний in situ.
Образование зон роста в отверстиях пористой пластины размещением в них мембран и нанесением покрытия позволяет быстро выращивать колонии без ограничения этих зон. Мембраны играют роль барьеров, задерживающих клетки в зонах роста после подачи суспензии. Отверстия в пластине выполнены в виде цилиндров с гладкими стенками ортогонально большой плоскости пористой пластины и топологически кодированы, что позволяет усовершенствовать манипулирование колониями и наблюдение за их ростом. Топологическое кодирование отверстий упрощает наблюдение посредством цифровой видеокамеры. Цилиндрическая форма отверстий и их ортогональное расположение обеспечивают снижение энергетических затрат для отрыва колоний при гидроударе. Отверстия исполнены в виде сопел, определяющих скорость потока и его однородность. Возможно регулирование размера сопла и конфигурации мембраны, поддерживающей колонии микроорганизмов. Размер пор мембраны, не пропускающих микробные клетки, обеспечивает стерильность нижней емкости, что обуславливает одноразовое использование устройства.
Таким образом, описанное миниатюрное устройство обеспечивает автоматизацию подачи питательного раствора, отделения и переноса колоний бактерий.
МОБИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ
Итак, авторами предложены конструкция микро-
аналитического прибора и способ выращивания колоний микробных клеток, которые имеют следующие особенности:
• подача питательного раствора снизу вверх через пористую пластину из анодного оксида алюминия в сформированные на ее верхней поверхности зоны роста колоний клеток;
• подача микробных клеток на верхнюю поверхность пористой пластины из анодного оксида алюминия;
• создание контролируемых условий роста колоний;
• наблюдение за ростом колоний;
• отсоединение колоний микробных клеток от зон роста и перенос их во внешние средства идентификации.
Способ реализован в устройстве, содержащем пористую пластину из анодного оксида алюминия со сформированными на ее верхней поверхности зонами роста колоний. Нижняя поверхность пластины сопряжена с устройством для выращивания колоний микробных клеток при подаче питательного раствора. Мембраны изготовлены из анодного оксида алюминия, а крышка верхней емкости снабжена центральным окном с закрепленным в нем оптическим стеклом для наблюдения за ростом колоний.
Создание миниатюрных мобильных устройств для экспресс-идентификации патогенов и определения их чувствительности к антибиотикам с использованием "лаборатории на чипе" позволяет оперативно выбирать тактику лечения инфекционных заболеваний, повысить ее эффективность, децентрализовать микробиологический анализ, сделав его доступным для населения, в том числе удаленных районов. Низкая стоимость и доступность анализа создают предпосылки для повышения оперативности лабораторной диагностики при обнаружении и лечении инфекционных заболеваний.
* С.-Петербургский электротехнический университет им. В.И. Ульянова (Ленина) «ЛЭТИ»
Отзывы читателей
