eng
Выпуск #8/2013
И.Яминский, П.Горелкин, А.Ерофеев,О.Синицына, Г.Мешков
Бионаноскопия в биологии и медицине
Бионаноскопия в биологии и медицине
Просмотры: 5688
Инструменты наноаналитики открывают новые возможности в наблюдении живой природы на уровне молекул. Сверхвысокое разрешение и возможности измерений на воздухе и в жидких средах обуславливают широкие перспективы применения зондовой микроскопии в медицине. В обзоре обсуждается современное контрольно-измерительное оборудование, рассматриваются подложки для работы с биообъектами, обобщаются данные по наблюдению нуклеиновых кислот, белков, бактерий, клеток и тканей животных.
Теги: atomic balance atomic force microscopy bionanoscopy nanosansors scanning probe microscopy scanning tunneling microscopy атомно-силовая микроскопия атомные весы бионаноскопия наносенсоры сканирующая зондовая микроскопия сканирующая туннельная микроскопия
Наблюдение биологических объектов – наиболее интересное направление сканирующей зондовой микроскопии [1, 2]. Природа создает основные строительные единицы – нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды и другие наноструктуры – с точностью, пока недостижимой для человека. Не только химический состав биомакромолекул, но и их форма играют в биологии существенную роль. Например, молекула в разных пространственных расположениях может обладать различной ферментативной активностью. Ничтожное смещение реакционного центра фермента может привести к изменению соответствующей активности. Мельчайшие машины – белки АТФ-синтазы, имеющие неподвижный статор и подвижный ротор, – также объекты живой природы, а линейная плотность записи информации в ДНК или РНК находится в области абсолютных рекордов.
Бактериальная клетка – практически наименьшая форма живого организма. Ее размер не превышает нескольких микрон. Она во много раз меньше любого созданного человеком устройства, способного к перемещению в пространстве или к организации химических реакций.
Сканирующая зондовая микроскопия позволяет заглянуть в мир молекулярной биологии, микробиологии и выработать практические рекомендации для молекулярной медицины. Биологические наблюдения в зондовой микроскопии (ЗМ) имеют по сравнению с другими приложениями существенные особенности. Биологические объекты обладают низкой механической жесткостью, что требует особой деликатности. ЗМ не может наблюдать изолированные биомакромолекулы, например, свободно плавающие в буферных растворах, а требует их закрепления на твердой подложке. В связи с этим методики фиксации конкретных биообъектов должны быть тщательно проверены на практике. В ЗМ хорошо известны случаи, когда поспешные и непроверенные действия приводили к конфузам. Так, ступени на пиролитическом графите были приняты за молекулы ДНК, при этом наблюдаемый пространственный период ошибочно сопоставлялся с чередованием отдельных пар оснований [3]. Впоследствии было показано, что ДНК-подобные структуры наблюдаются лишь на чистом графите [4], поэтому выбор подложки играет ключевую роль. Подложка должна оказывать минимальное влияние на конформационное состояние биообъектов. С другой стороны, сцепление с нею должно быть достаточно сильным, чтобы при взаимодействии с зондом микроскопа не происходило открепление наблюдаемого объекта от подложки. Многие объекты молекулярной биологии имеют размер в несколько нанометров, поэтому используемые подложки обязаны иметь шероховатость как минимум на порядок ниже. Традиционные подложки для нано- и микрообъектов биологии – графит и слюда. Эти материалы легко скалываются по плоскости спайности, обнажая две абсолютно чистые кристаллические плоские поверхности. Некоторые трудности возникают при дальнейшей химической обработке этих поверхностей, чтобы они стали пригодными для адсорбции биомакромолекул или адгезии больших объектов, например бактерий.
Следует сказать несколько слов о месте ЗМ в ряду других аналитических методов высокого разрешения. Растровая и просвечивающая электронная микроскопия в вакууме обеспечивает более высокое пространственное разрешение при наблюдении нуклеиновых кислот, белковых молекул и вирусных частиц по сравнению с ЗМ в вакууме или на воздухе. В частности, электронная микроскопия позволяет увидеть упаковку белковых субъединиц оболочки вируса табачной мозаики или вируса полиомиелита. Разрешение такого качества пока не достигнуто в ЗМ, однако при наблюдении в жидкостях конкурентов у нее практически нет. Отметим, что электронная микроскопия лучше передает ширину объектов, но измерение высоты с ее помощью весьма затруднено. Напротив, ЗМ обеспечивает получение трехмерных изображений, в которых присутствуют латеральные размеры и высота. Ядерный магнитный резонанс и рентгено-структурный анализ также дают больше информации о строении биомакромолекул и взаимном расположении отдельных атомов, составляющих биомакромолекулы. Однако у ЗМ нет конкурентов, когда следует детально рассмотреть структуру точечного дефекта или дислокации на поверхности кристалла. Методы ядерного магнитного резонанса или рентгено-структурного анализа позволяют считывать сигнал от многих миллионов одинаковых молекул и судить о структуре одной из таких молекул. В этом смысле они интегральные, а ЗМ – метод локальный и может изучать одиночную молекулу или их небольшой ансамбль.
Аппаратура сканирующей зондовой микроскопии
Современная медицина все более персонализируется – растут требования к соответствию методик лечения особенностям каждого пациента. В этих условиях формируется потребность в технологических комплексах, способных быстро и всесторонне анализировать биологический материал на уровне отдельных клеток и биомакромолекул. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) имеет хорошие перспективы во многих направлениях современной диагностической медицины. Более того, эффективная интеграция разных методов анализа и их исключительно высокая чувствительность делают такую платформу уникальной.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) – единственный в настоящее время метод, который позволяет продвинуть микрохирургию на наноуровень. Отвечая требованиям к точности, воспроизводимости и автоматизации воздействия на клетки, он может придать новый импульс развитию клеточных технологий, в том числе в медицинской практике. Одновременно АСМ является современным и перспективным методом научных исследований, который обеспечивает следующие преимущества:
получение трехмерного изображения исследуемых объектов с атомарным и молекулярным разрешением;
исследование объектов, находящихся в жидкой среде;
высокая пространственная точность и локализация воздействия методом силовой нанолитографии.
Суть силовой нанолитографии состоит в использовании зонда атомно-силового микроскопа (кантилевера) в качестве инструмента для точечного воздействия на поверхность. Хотя метод широко используется для создания микро- и наноразмерных рельефов на неживых объектах (в основном на синтетических полимерах), его применение к живым системам ограничивается единичными экспериментами. Поэтому использование АСМ для микрохирургических операций на клетках и клеточных структурах – новый подход в отечественной и мировой науке.
В настоящее время СЗМ производятся в России, США, Германии, Японии, Китае и других странах. По сути дела, они стали настольными приборами, используемыми в реальных нанотехнологиях, в том числе в материаловедении, биологии и медицине.
На рис.1 приведено изображение механической системы сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан" производства компании "Центр перспективных технологий" и НПП "Центр перспективных технологий" (www.nanoscopy.ru). Важно отметить, что в простом контактном режиме зондовый микроскоп можно рассматривать как профилометр с субнанометровым пространственным разрешением (рис.2).
Графит как подложка для бионаноскопии
Чтобы рассмотреть объект на атомном и молекулярном уровне, необходимо использовать специальные атомно-гладкие подложки. Для этого применяются слоистые кристаллы, при сколе которых получают чистые и гладкие поверхности. Наиболее часто используются кристаллы слюды и графита. У графита имеется ряд важных преимуществ:
он проводит электрический ток, что позволяет исследовать объекты не только атомно-силовой, но и сканирующей туннельной, сканирующей резистивной микроскопией;
поверхность графита инертна, из нее не высвобождаются ионы при помещении в водные растворы, что может значительно влиять на их ионную силу вблизи подложки.
Графитовая подложка оказывает меньшее воздействие на адсорбированные на ней объекты. Например, измеряемая в АСМ высота молекул ДНК на поверхности графита оказывается приблизительно в два раза больше, чем молекул ДНК, адсорбированных на поверхности слюды [5].
Однако, по сравнению со слюдой, для графита характерна большая частота появления кристаллических дефектов на поверхности скола. Поэтому, чтобы исключить ошибочную интерпретацию изображений при использовании графита в медико-биологических исследованиях, очень важно иметь представления об основных типах дефектов на его поверхности.
Дефекты, наблюдаемые на поверхности сколов графита, можно разделить на две группы: проявляющиеся на топографических изображениях и плоские, которые не создают на поверхности рельеф, но способны повлиять на процесс адсорбции биообъектов.
Ступени скола
К наиболее распространенным дефектам поверхности графита следует отнести ступени скола (рис.3). Они имеют направление, совпадающее с направлением скола. Для образцов высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) с мозаичностью 0,4° и 0,8° протяженность ступеней скола на единицу площади поверхности составляет 1–3 мкм–1.
Чем меньше угол мозаичности для такого графита, тем меньше высота ступеней скола. Так, при мозаичности 0,4° доля однослойных ступеней – около 50%, при мозаичности 0,8° – около 35%.
Винтовые дислокации
Часть ступеней скола обрывается в центре террас графита. Причиной этого является выход винтовых дислокаций, линии которых направлены перпендикулярно поверхности (рис.4). Следует отметить, что часто от винтовой дислокации берет свое начало краевая дислокация, линия которой лежит в глубине под несколькими атомными слоями графита. Переход винтовой дислокации в краевую говорит о небольшой протяженности первой вглубь графита.
Краевые дислокации
Краевые дислокации видны на атомно-силовом микроскопе, сканирующем туннельном микроскопе (СТМ) и сканирующем резистивном микроскопе (СРМ) в виде ступеней, соответствующих обрывам атомных слоев графита. В отличие от ступеней скола, линии краевых дислокаций имеют причудливую форму и, как правило, замкнуты в петли. Приповерхностная структура ВОПГ хорошо видна при удалении крупных деталей рельефа поверхности путем вычитания сплайна поверхности из изображений (рис.5). Размеры петель варьируются от нескольких десятков нанометров до нескольких микрометров.
Во многих случаях высоты краевых дислокаций не превышают 0,3 нм, что меньше межслоевого расстояния в графите. Это связано с их удалением от поверхности. Сглаживание рельефа происходит сравнительно медленно. В АСМ-экспериментах наблюдались краевые дислокации, лежащие на глубине более 4 нм. Поверхностная плотность краевых дислокаций для графита с мозаичностью 0,4° и 0,8° – около 1 мкм–1.
Волокна
Структуры в виде волокон (рис.6) наблюдаются на сколах ВОПГ достаточно редко. Их диаметр непостоянен и уменьшается ближе к концу. Если волокно оказалось под поверхностью скола, то поверхностные атомные слои изгибаются в месте его прохождения. В области прохождения волокон верхние атомные слои могут искривляться на десятки нанометров по высоте, при этом ширина искривленной области может составлять более 1 мкм.
Звезды
Одним из самых необычных дефектов на поверхности графита являются звезды (рис.7). По одной из версий, они являются результатом воздействия иглы, которая при подводе врезается в поверхность ВОПГ, затем резко отводится, и вместе с ней поднимаются верхние слои, пока упругая энергия их деформации не превысит энергию образования трещин. Однако эксперименты по вдавливанию острия иглы в поверхность приводили к образованию кратера со значительно менее упорядоченной структурой.
Согласно другой гипотезе, звезды образуются при скалывании ВОПГ в местах, где структура графита сильно напряжена (сжатая пора, включение другой фазы с сильно отличающимися характеристиками). Упругая энергия деформации идет в дальнейшем на развитие трещин и загиб лепестков. В пользу второй версии говорит то обстоятельство, что на кадрах может присутствовать сразу несколько звезд.
Межзеренные границы
ВОПГ является поликристаллом, для которого оси всех кристаллитов ориентированы одинаково, однако в плоскости поверхности ориентация кристаллитов произвольна. Размеры кристаллитов – около
10 мкм, поэтому стыки зерен могут встречаться достаточно часто. Межзеренные границы выглядят на СТМ-изображениях как нити с высотой от 0,1 до 0,3 нм и диаметром от 2 до 5 нм. В АСМ межзеренные границы наблюдаются редко, так как во многих случаях имеют плоскую структуру. Межзеренные границы могут наблюдаться также с помощью микроскопии латеральных сил.
Интересно отметить, что ступени скола не прерываются, проходя через межзеренную границу. На рис.8 показан стык трех зерен. В области стыка границы сходятся под углами, близкими к 120°. Эти границы имеют периодическую структуру. Чем больше угол между соседними зернами, тем меньше период границы. На поверхности графита наблюдались границы с периодом до 25 нм.
Дислокационные ряды
В местах прохождения дислокационных рядов, изменения высоты поверхности ВОПГ не происходит, поэтому обычно в АСМ данные дефекты не наблюдаются. Однако если проводить измерения в СТМ или СРМ, то на атомно-гладких террасах можно обнаружить структуры в виде групп полос (рис.9). Возникновение данных дефектов связано с деформацией графита. На недеформированной поверхности ВОПГ дислокационные ряды наблюдаются редко. Если перед съемкой изогнуть тонкий кусочек графита, то количество дислокационных рядов значительно возрастет.
Дислокационный ряд состоит из двух частичных дислокаций, между которыми расположен дефект упаковки. Ширина полос обычно составляет от 15 до 65 нм. В местах закрепления на ступенях или межзеренных границах дислокационные полосы расширяются до 60–70 нм. В СТМ дислокационным рядам соответствует высота от 0,08 до 0,18 нм. Контраст дислокационных рядов может инвертироваться, т.е. область дефекта упаковки может быть как выше, так и ниже соседних с полосой областей. Этот эффект пока не нашел объяснения. Предполагается, что он может быть связан с изменением состояния кончика иглы в процессе сканирования. Во многих случаях дислокационные ряды наблюдаются целыми группами с периодом от 26 до 170 нм.
Дислокационные сетки
Дислокационные сетки образуются в месте пересечения дислокационных рядов различных направлений. Как и дислокационные ряды, они не наблюдаются в АСМ, но могут быть обнаружены с помощью СТМ и СРМ. Дислокационная сетка состоит из тре-
угольников. Стороны треугольников соответствуют частичным дислокациям, разграничивающим области дефекта упаковки и бездефектного графита. Треугольники, содержащие дефект упаковки, имеют вогнутые границы. Во время сканирования контраст дислокационных сеток также может инвертироваться. Например, на рис.10 дефектам упаковки соответствуют темные треугольники. Как правило, на СТМ-изображениях высота треугольников не превышает 1 нм.
Муары
Гексагональные сверхрешетки (муары) образуются при повороте атомных слоев графита относительно друг друга (рис.11). Области со сверхрешеткой в большинстве случаев ограничены ступенями скола и межзеренными границами. Чем меньше угол поворота атомных слоев графита относительно друг друга, тем больше период муара.
Симметрия муаров полностью соответствует симметрии кристаллической решетки графита. Муары могут наблюдаться с помощью СТМ и СРМ. Для СТМ-изображений характерны высоты муаров от 0,05 до 0,70 нм и периоды от 1,7 до 44 нм. В АСМ муары не видны, так как поверхность остается плоской.
Точечные дефекты
Оценки показывают, что на поверхности ВОПГ различного качества концентрация точечных дефектов в нормальных условиях может составлять до 20 мкм–2. Они проявляются яркими пятнами на СТМ-изображениях. При приближении иглы к поверхности дефекты оказываются невидимыми, так как в данных условиях основной вклад в туннелирование вносят объемные состояния графита.
Локальная плотность состояний вблизи участка поверхности с пропущенным атомом (вакансией) возрастает, поэтому вакансии могут быть легко визуализированы с помощью СТМ, но для АСМ на воздухе при комнатной температуре они невидимы. На рис.12 показаны точечные дефекты, созданные на поверхности графита методом локального анодного окисления.
Окончание в следующем номере
Литература
Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров. Под ред. И.В.Яминского. М.: Научный мир, 1997.
Яминский И.В. Современные достижения бионаноскопии. – Мир физики и техники. Успехи наноинженерии: электроника, материалы, структуры. Под ред. Дж. Дэвиса М. Томпсона. Техносфера, 2011, с.355–372.
Dunlap D.D., Bustamante C. Images of single-stranded nucleic acids by scanning tunneling microscopy. – Nature, 1989, 342, p.204–206.
Clemmer C.R., Beebe T.P. Graphite: A mimic for DNA and other biomolecules in scanning tunneling microscopes studies. – Science, 1991, 251, p.640–642.
Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Scanning probe microscopy of DNA on mica and graphite. – AIP conference proceedings volume
No. 696. STM'03, Eindhoven University of Technology, July 21–25, 2003 Eindhoven, the Netherlands), p. 452-456 (2003).
Бактериальная клетка – практически наименьшая форма живого организма. Ее размер не превышает нескольких микрон. Она во много раз меньше любого созданного человеком устройства, способного к перемещению в пространстве или к организации химических реакций.
Сканирующая зондовая микроскопия позволяет заглянуть в мир молекулярной биологии, микробиологии и выработать практические рекомендации для молекулярной медицины. Биологические наблюдения в зондовой микроскопии (ЗМ) имеют по сравнению с другими приложениями существенные особенности. Биологические объекты обладают низкой механической жесткостью, что требует особой деликатности. ЗМ не может наблюдать изолированные биомакромолекулы, например, свободно плавающие в буферных растворах, а требует их закрепления на твердой подложке. В связи с этим методики фиксации конкретных биообъектов должны быть тщательно проверены на практике. В ЗМ хорошо известны случаи, когда поспешные и непроверенные действия приводили к конфузам. Так, ступени на пиролитическом графите были приняты за молекулы ДНК, при этом наблюдаемый пространственный период ошибочно сопоставлялся с чередованием отдельных пар оснований [3]. Впоследствии было показано, что ДНК-подобные структуры наблюдаются лишь на чистом графите [4], поэтому выбор подложки играет ключевую роль. Подложка должна оказывать минимальное влияние на конформационное состояние биообъектов. С другой стороны, сцепление с нею должно быть достаточно сильным, чтобы при взаимодействии с зондом микроскопа не происходило открепление наблюдаемого объекта от подложки. Многие объекты молекулярной биологии имеют размер в несколько нанометров, поэтому используемые подложки обязаны иметь шероховатость как минимум на порядок ниже. Традиционные подложки для нано- и микрообъектов биологии – графит и слюда. Эти материалы легко скалываются по плоскости спайности, обнажая две абсолютно чистые кристаллические плоские поверхности. Некоторые трудности возникают при дальнейшей химической обработке этих поверхностей, чтобы они стали пригодными для адсорбции биомакромолекул или адгезии больших объектов, например бактерий.
Следует сказать несколько слов о месте ЗМ в ряду других аналитических методов высокого разрешения. Растровая и просвечивающая электронная микроскопия в вакууме обеспечивает более высокое пространственное разрешение при наблюдении нуклеиновых кислот, белковых молекул и вирусных частиц по сравнению с ЗМ в вакууме или на воздухе. В частности, электронная микроскопия позволяет увидеть упаковку белковых субъединиц оболочки вируса табачной мозаики или вируса полиомиелита. Разрешение такого качества пока не достигнуто в ЗМ, однако при наблюдении в жидкостях конкурентов у нее практически нет. Отметим, что электронная микроскопия лучше передает ширину объектов, но измерение высоты с ее помощью весьма затруднено. Напротив, ЗМ обеспечивает получение трехмерных изображений, в которых присутствуют латеральные размеры и высота. Ядерный магнитный резонанс и рентгено-структурный анализ также дают больше информации о строении биомакромолекул и взаимном расположении отдельных атомов, составляющих биомакромолекулы. Однако у ЗМ нет конкурентов, когда следует детально рассмотреть структуру точечного дефекта или дислокации на поверхности кристалла. Методы ядерного магнитного резонанса или рентгено-структурного анализа позволяют считывать сигнал от многих миллионов одинаковых молекул и судить о структуре одной из таких молекул. В этом смысле они интегральные, а ЗМ – метод локальный и может изучать одиночную молекулу или их небольшой ансамбль.
Аппаратура сканирующей зондовой микроскопии
Современная медицина все более персонализируется – растут требования к соответствию методик лечения особенностям каждого пациента. В этих условиях формируется потребность в технологических комплексах, способных быстро и всесторонне анализировать биологический материал на уровне отдельных клеток и биомакромолекул. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) имеет хорошие перспективы во многих направлениях современной диагностической медицины. Более того, эффективная интеграция разных методов анализа и их исключительно высокая чувствительность делают такую платформу уникальной.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) – единственный в настоящее время метод, который позволяет продвинуть микрохирургию на наноуровень. Отвечая требованиям к точности, воспроизводимости и автоматизации воздействия на клетки, он может придать новый импульс развитию клеточных технологий, в том числе в медицинской практике. Одновременно АСМ является современным и перспективным методом научных исследований, который обеспечивает следующие преимущества:
получение трехмерного изображения исследуемых объектов с атомарным и молекулярным разрешением;
исследование объектов, находящихся в жидкой среде;
высокая пространственная точность и локализация воздействия методом силовой нанолитографии.
Суть силовой нанолитографии состоит в использовании зонда атомно-силового микроскопа (кантилевера) в качестве инструмента для точечного воздействия на поверхность. Хотя метод широко используется для создания микро- и наноразмерных рельефов на неживых объектах (в основном на синтетических полимерах), его применение к живым системам ограничивается единичными экспериментами. Поэтому использование АСМ для микрохирургических операций на клетках и клеточных структурах – новый подход в отечественной и мировой науке.
В настоящее время СЗМ производятся в России, США, Германии, Японии, Китае и других странах. По сути дела, они стали настольными приборами, используемыми в реальных нанотехнологиях, в том числе в материаловедении, биологии и медицине.
На рис.1 приведено изображение механической системы сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан" производства компании "Центр перспективных технологий" и НПП "Центр перспективных технологий" (www.nanoscopy.ru). Важно отметить, что в простом контактном режиме зондовый микроскоп можно рассматривать как профилометр с субнанометровым пространственным разрешением (рис.2).
Графит как подложка для бионаноскопии
Чтобы рассмотреть объект на атомном и молекулярном уровне, необходимо использовать специальные атомно-гладкие подложки. Для этого применяются слоистые кристаллы, при сколе которых получают чистые и гладкие поверхности. Наиболее часто используются кристаллы слюды и графита. У графита имеется ряд важных преимуществ:
он проводит электрический ток, что позволяет исследовать объекты не только атомно-силовой, но и сканирующей туннельной, сканирующей резистивной микроскопией;
поверхность графита инертна, из нее не высвобождаются ионы при помещении в водные растворы, что может значительно влиять на их ионную силу вблизи подложки.
Графитовая подложка оказывает меньшее воздействие на адсорбированные на ней объекты. Например, измеряемая в АСМ высота молекул ДНК на поверхности графита оказывается приблизительно в два раза больше, чем молекул ДНК, адсорбированных на поверхности слюды [5].
Однако, по сравнению со слюдой, для графита характерна большая частота появления кристаллических дефектов на поверхности скола. Поэтому, чтобы исключить ошибочную интерпретацию изображений при использовании графита в медико-биологических исследованиях, очень важно иметь представления об основных типах дефектов на его поверхности.
Дефекты, наблюдаемые на поверхности сколов графита, можно разделить на две группы: проявляющиеся на топографических изображениях и плоские, которые не создают на поверхности рельеф, но способны повлиять на процесс адсорбции биообъектов.
Ступени скола
К наиболее распространенным дефектам поверхности графита следует отнести ступени скола (рис.3). Они имеют направление, совпадающее с направлением скола. Для образцов высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) с мозаичностью 0,4° и 0,8° протяженность ступеней скола на единицу площади поверхности составляет 1–3 мкм–1.
Чем меньше угол мозаичности для такого графита, тем меньше высота ступеней скола. Так, при мозаичности 0,4° доля однослойных ступеней – около 50%, при мозаичности 0,8° – около 35%.
Винтовые дислокации
Часть ступеней скола обрывается в центре террас графита. Причиной этого является выход винтовых дислокаций, линии которых направлены перпендикулярно поверхности (рис.4). Следует отметить, что часто от винтовой дислокации берет свое начало краевая дислокация, линия которой лежит в глубине под несколькими атомными слоями графита. Переход винтовой дислокации в краевую говорит о небольшой протяженности первой вглубь графита.
Краевые дислокации
Краевые дислокации видны на атомно-силовом микроскопе, сканирующем туннельном микроскопе (СТМ) и сканирующем резистивном микроскопе (СРМ) в виде ступеней, соответствующих обрывам атомных слоев графита. В отличие от ступеней скола, линии краевых дислокаций имеют причудливую форму и, как правило, замкнуты в петли. Приповерхностная структура ВОПГ хорошо видна при удалении крупных деталей рельефа поверхности путем вычитания сплайна поверхности из изображений (рис.5). Размеры петель варьируются от нескольких десятков нанометров до нескольких микрометров.
Во многих случаях высоты краевых дислокаций не превышают 0,3 нм, что меньше межслоевого расстояния в графите. Это связано с их удалением от поверхности. Сглаживание рельефа происходит сравнительно медленно. В АСМ-экспериментах наблюдались краевые дислокации, лежащие на глубине более 4 нм. Поверхностная плотность краевых дислокаций для графита с мозаичностью 0,4° и 0,8° – около 1 мкм–1.
Волокна
Структуры в виде волокон (рис.6) наблюдаются на сколах ВОПГ достаточно редко. Их диаметр непостоянен и уменьшается ближе к концу. Если волокно оказалось под поверхностью скола, то поверхностные атомные слои изгибаются в месте его прохождения. В области прохождения волокон верхние атомные слои могут искривляться на десятки нанометров по высоте, при этом ширина искривленной области может составлять более 1 мкм.
Звезды
Одним из самых необычных дефектов на поверхности графита являются звезды (рис.7). По одной из версий, они являются результатом воздействия иглы, которая при подводе врезается в поверхность ВОПГ, затем резко отводится, и вместе с ней поднимаются верхние слои, пока упругая энергия их деформации не превысит энергию образования трещин. Однако эксперименты по вдавливанию острия иглы в поверхность приводили к образованию кратера со значительно менее упорядоченной структурой.
Согласно другой гипотезе, звезды образуются при скалывании ВОПГ в местах, где структура графита сильно напряжена (сжатая пора, включение другой фазы с сильно отличающимися характеристиками). Упругая энергия деформации идет в дальнейшем на развитие трещин и загиб лепестков. В пользу второй версии говорит то обстоятельство, что на кадрах может присутствовать сразу несколько звезд.
Межзеренные границы
ВОПГ является поликристаллом, для которого оси всех кристаллитов ориентированы одинаково, однако в плоскости поверхности ориентация кристаллитов произвольна. Размеры кристаллитов – около
10 мкм, поэтому стыки зерен могут встречаться достаточно часто. Межзеренные границы выглядят на СТМ-изображениях как нити с высотой от 0,1 до 0,3 нм и диаметром от 2 до 5 нм. В АСМ межзеренные границы наблюдаются редко, так как во многих случаях имеют плоскую структуру. Межзеренные границы могут наблюдаться также с помощью микроскопии латеральных сил.
Интересно отметить, что ступени скола не прерываются, проходя через межзеренную границу. На рис.8 показан стык трех зерен. В области стыка границы сходятся под углами, близкими к 120°. Эти границы имеют периодическую структуру. Чем больше угол между соседними зернами, тем меньше период границы. На поверхности графита наблюдались границы с периодом до 25 нм.
Дислокационные ряды
В местах прохождения дислокационных рядов, изменения высоты поверхности ВОПГ не происходит, поэтому обычно в АСМ данные дефекты не наблюдаются. Однако если проводить измерения в СТМ или СРМ, то на атомно-гладких террасах можно обнаружить структуры в виде групп полос (рис.9). Возникновение данных дефектов связано с деформацией графита. На недеформированной поверхности ВОПГ дислокационные ряды наблюдаются редко. Если перед съемкой изогнуть тонкий кусочек графита, то количество дислокационных рядов значительно возрастет.
Дислокационный ряд состоит из двух частичных дислокаций, между которыми расположен дефект упаковки. Ширина полос обычно составляет от 15 до 65 нм. В местах закрепления на ступенях или межзеренных границах дислокационные полосы расширяются до 60–70 нм. В СТМ дислокационным рядам соответствует высота от 0,08 до 0,18 нм. Контраст дислокационных рядов может инвертироваться, т.е. область дефекта упаковки может быть как выше, так и ниже соседних с полосой областей. Этот эффект пока не нашел объяснения. Предполагается, что он может быть связан с изменением состояния кончика иглы в процессе сканирования. Во многих случаях дислокационные ряды наблюдаются целыми группами с периодом от 26 до 170 нм.
Дислокационные сетки
Дислокационные сетки образуются в месте пересечения дислокационных рядов различных направлений. Как и дислокационные ряды, они не наблюдаются в АСМ, но могут быть обнаружены с помощью СТМ и СРМ. Дислокационная сетка состоит из тре-
угольников. Стороны треугольников соответствуют частичным дислокациям, разграничивающим области дефекта упаковки и бездефектного графита. Треугольники, содержащие дефект упаковки, имеют вогнутые границы. Во время сканирования контраст дислокационных сеток также может инвертироваться. Например, на рис.10 дефектам упаковки соответствуют темные треугольники. Как правило, на СТМ-изображениях высота треугольников не превышает 1 нм.
Муары
Гексагональные сверхрешетки (муары) образуются при повороте атомных слоев графита относительно друг друга (рис.11). Области со сверхрешеткой в большинстве случаев ограничены ступенями скола и межзеренными границами. Чем меньше угол поворота атомных слоев графита относительно друг друга, тем больше период муара.
Симметрия муаров полностью соответствует симметрии кристаллической решетки графита. Муары могут наблюдаться с помощью СТМ и СРМ. Для СТМ-изображений характерны высоты муаров от 0,05 до 0,70 нм и периоды от 1,7 до 44 нм. В АСМ муары не видны, так как поверхность остается плоской.
Точечные дефекты
Оценки показывают, что на поверхности ВОПГ различного качества концентрация точечных дефектов в нормальных условиях может составлять до 20 мкм–2. Они проявляются яркими пятнами на СТМ-изображениях. При приближении иглы к поверхности дефекты оказываются невидимыми, так как в данных условиях основной вклад в туннелирование вносят объемные состояния графита.
Локальная плотность состояний вблизи участка поверхности с пропущенным атомом (вакансией) возрастает, поэтому вакансии могут быть легко визуализированы с помощью СТМ, но для АСМ на воздухе при комнатной температуре они невидимы. На рис.12 показаны точечные дефекты, созданные на поверхности графита методом локального анодного окисления.
Окончание в следующем номере
Литература
Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров. Под ред. И.В.Яминского. М.: Научный мир, 1997.
Яминский И.В. Современные достижения бионаноскопии. – Мир физики и техники. Успехи наноинженерии: электроника, материалы, структуры. Под ред. Дж. Дэвиса М. Томпсона. Техносфера, 2011, с.355–372.
Dunlap D.D., Bustamante C. Images of single-stranded nucleic acids by scanning tunneling microscopy. – Nature, 1989, 342, p.204–206.
Clemmer C.R., Beebe T.P. Graphite: A mimic for DNA and other biomolecules in scanning tunneling microscopes studies. – Science, 1991, 251, p.640–642.
Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Scanning probe microscopy of DNA on mica and graphite. – AIP conference proceedings volume
No. 696. STM'03, Eindhoven University of Technology, July 21–25, 2003 Eindhoven, the Netherlands), p. 452-456 (2003).
Отзывы читателей
