eng
Выпуск #1/2014
И.Яминский, П.Горелкин, А.Ерофеев, О.Синицына, Г.Мешков
Бионаноскопия в биологии и медицине
Бионаноскопия в биологии и медицине
Просмотры: 4391
Инструменты наноаналитики открывают новые возможности в исследовании живой природы. В обзоре обобщаются данные наблюдения нуклеиновых кислот, белков, бактерий, клеток и тканей животных.
Теги: atomic balance bionanoscopy nanosansors scanning microscopy атомные весы бионаноскопия. наносенсоры сканирующая микроскопия
С разработкой сканирующей туннельной микроскопии (СТМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) появилась возможность исследовать молекулы ДНК. Первоначальные наблюдения с помощью СТМ плохо воспроизводились и имели серьезные артефакты. Проблемы туннельной микроскопии заключались не только в подложке – графите, не обладающем необходимой адсорбционной способностью, но и в туннелировании электронов вблизи поверхности молекулы.
ДНК
При надежном закреплении ДНК на модифицированной поверхности графита она видна в отрицательном контрасте не как возвышение, что характерно для большинства объектов с конечной электропроводностью, а как углубление [1]. Хорошо воспроизводимые и информативные результаты (рис.1 и 2) были получены, когда для исследования ДНК применили АСМ и заимствованные из электронной микроскопии методы осаждения на поверхности слюды. В водном растворе ДНК и поверхность свежесколотой слюды имеют отрицательный заряд, поэтому между ними возникает кулоновское отталкивание. Для гашения отрицательного заряда необходимы растворы двухвалентных ионов. Хорошие результаты достигаются, когда слюда модифицируется небольшими концентрациями органических веществ: аминопропилтри-
этоксисиланом или силатраном. Такая поверхность дает незначительный фон, не препятствуя получению качественных изображений ДНК.
АСМ позволяет изучать конформационные состояния молекул ДНК в растворах [3]. Для оценки геометрии биомакромолекулы ее необходимо закрепить на подложке – тогда наблюдается конформация не свободно плавающей в растворе молекулы, а закрепленной на межфазной границе жидкость–твердое тело. При этом надо быть уверенным в минимальном воздействии подложки.
РНК
РНК – более сложный объект, чем ДНК, так как ее молекула менее жесткая и требует особенно деликатного обращения. В одном из первых наблюдений [4] для устранения возможных артефактов были последовательно рассмотрены РНК-содержащие вирусные частицы (вирус табачной мозаики), промежуточные стадии частичного разрушения белковой оболочки (рис.3), свободные концы РНК и момент освобождения молекул от белковой оболочки под действием мочевины. Полезную информацию для молекулярной биологии дали исследования комплексообразования РНК с различными белками, в частности транспортными.
Белки. Одиночные молекулы и комплексы
Размеры отдельных белковых молекул сравнимы с радиусом закругления зонда АСМ, поэтому субмолекулярное разрешение удается получать только при исследовании белков высокой молекулярной массы. Обеспечить упаковку цепей в небольших белках, например лизоциме (молекулярная масса 14 кД), пока не удавалось. При этом известны работы, где надежно отличались белковые мономеры от димеров и мультимеров (рис.4 [5]).
Зондовую микроскопию (ЗМ) можно использовать для регистрации специфического связывания антиген–антитело. Измерения размеров отдельных частиц и достигаемая точность позволяют отделить одиночные антитела и антигены от их комплексов. ЗМ дает возможность получить информацию о характере агрегирования белков и их связывания с нуклеиновыми кислотами. В [6], например, определен характер связывания транспортного белка с вирусной РНК (рис.5).
Белковые Кристаллы
Достоинством ЗМ при наблюдении белковых кристаллов в насыщенных растворах является возможность регистрации динамики процессов в жидких средах, естественных для многих биологических объектов. Исследования позволили зарегистрировать кинетику роста дислокационных холмов и двумерных зародышей многих белковых кристаллов на уровне отдельных молекул [7, 8]. Например, для лизоцима были измерены скорость движения ступеней и изломов, вероятность присоединения и отсоединения строительных единиц, зависимость кинетических параметров от таких факторов, как температура и пересыщение [9].
АСМ позволяет наблюдать структуру поверхности растущего кристалла с молекулярным разрешением и изучать упаковку молекул вблизи точечных дефектов, что недоступно для других методов. В [10] обнаружена реконструкция поверхности кристалла, когда упаковка белковых молекул на ней отличается от объемной структуры (рис.6 и 7).
Вирусы
Хотя по своему разрешению ЗМ проигрывает электронной микроскопии, большая легкость в приготовлении образцов оправдывает ее применение при исследовании вирусов для качественного анализа их морфологии. Основное применение ЗМ в вирусологии следует искать не в определении строения вирусов, а в изучении происходящих с ними процессов.
Процессы кристаллизации наблюдали для различных вирусов [11, 12]. Этапы разрушения белковой оболочки вируса табачной мозаики с освобождением РНК зарегистрированы в [4]. Поскольку АСМ позволяет измерять механические свойства наноструктур, для вирусных частиц определен модуль Юнга при их поперечном сжатии зондом: для вируса табачной мозаики он составляет от 3·109 до 4·109 Па, а для менее жесткого Х-вируса картофеля – 8·108 Па (рис.8). Хорошее соответствие экспериментам обеспечивают расчеты, основанные на модели деформации Герца (рис.9).
Вирус табачной мозаики можно использовать в качестве тестовой структуры [13] для калибровки Z-перемещения АСМ и как эталон жесткости (рис.10). Исследования показали, что вирусы могут быть средством доставки наночастиц в ткани человека. Также они нашли применение при экологически безопасном производстве наночастиц с использованием растений [14].
Бактериальные клетки
Бактерии можно считать практически идеальным объектом для ЗМ. Они имеют микронные размеры, поэтому можно наблюдать отдельные клетки и их колонии, а также изучать фрагменты клеток [2]. Бактериальные клетки имеют жесткий полимерный каркас и не деформируются при сканировании зондом микроскопа. Для наблюдения бактерий на воздухе выращенные в питательной среде клетки переносятся в дистиллированную воду до концентрации около 109/мл (краткосрочное пребывание в воде не приводит к разрушению бактерий). Капля в несколько мкл помещается на свежесколотую слюду, и вода смачивает ее, образуя тонкую пленку, после удаления которой одиночные клетки осаждаются на подложке или формируют монослойные покрытия.
АСМ позволяет получать трехмерные изображения клеток бактерий (рис.11). Эти данные могут служить дополнительным критерием при составлении определителей бактерий. При наблюдении в жидкости контраст изображений падает, что объясняется наличием подвижных полимерных цепей наружной мембраны. На рис.12 приведено изображение бактериальных клеток E.coli в буферном растворе [15].
АСМ дает возможность надежно регистрировать структурные изменения на поверхности наружной мембраны клеточной стенки. На рис.13 изображена родительская бактерия Escherichia coli и генно- модифицированная бактерия, в исходную ДНК которой вставлен ген rfb-a3,4, отвечающий за синтез О-специфических боковых цепей липополисахаридов. Эти цепи создают на поверхности клетки ламелярную структуру, по морфологии существенно отличающуюся от поверхности родительской клетки [16].
Клетки высших организмов
Клетки высших организмов – животных и растений – не обладают высокой жесткостью, поэтому взаимодействие с зондом приводит к их деформации и увеличению площади контакта зонда с поверхностью клетки, что снижает пространственное разрешение [17]. С другой стороны, ЗМ дает возможность измерять не только механическую жесткость отдельных клеток, но и их адгезивные и фрикционные свойства.
ЗМ позволяет наблюдать динамические процессы, происходящие с клетками. Например, визуализировано движение остеобластов мышей по поверхности стеклянной подложки [18]; образование агрегатов этих клеток и агрегация фибробластов куриных эмбрионов; получены АСМ-изображения первичных остеобластов мышей при клеточном делении; исследованы изменения клеточной поверхности, сопутствующие апоптозу клеток остеосаркомы. Сканирование поверхности клеток острием зонда позволяет визуализировать некоторые детали их внутреннего строения. Так, на поверхности клетки можно различить под мембраной элементы цитоскелета, а на снимке делящегося остеобласта отчетливо видно раздваивающееся клеточное ядро.
Помимо морфологического анализа с нанометровым разрешением, возможно определение механических параметров мембраны клеток и нахождение с помощью оптических меток расположения клеточных рецепторов. Также ЗМ может применяться для диагностических целей, например, в реаниматологии [19].
Авторы впервые прямым методом показали характер повреждения (образование нанопор) стенок эритроцита при электропорации различной интенсивности. Исследования проводились на венозной крови человека. Кровь (1,2 мл) помещалась в кварцевую кювету с титановыми электродами, расстояние между которыми составляло 15 мм. На электроды подавался импульс электрического поля. В качестве источника калиброванного поля использовался клинический дефибриллятор Lifepak 7 (США). При напряженности поля E в растворе 1100 В/см и длительности импульса 10 мс наведенный трансмембранный потенциал превышал пороговый потенциал пробоя мембраны (φпор = 300÷500 мВ), и происходила их необратимая электропорация.
Уменьшение числа эритроцитов вследствие гемолиза, а следовательно, электропорация, оценивалось по кинетической кривой – зависимости D(t), где D – оптическая плотность суспензии крови. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов описывались экспоненциальной функцией:
D(t) = D0exp(–βt) + D1,
где β – константа скорости уменьшения числа эритроцитов, D1 – остаточный уровень клеток, D0 – начальное число эритроцитов. Исследование поверхности эритроцитов до и после воздействия электрического поля проводилось на мазках крови по стандартной методике при комнатной температуре.
Изображения поверхности мембран (рис.14) были получены на кафедре полимеров и кристаллов физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова с помощью атомного силового микроскопа "ФемтоСкан", разработанного НПП "Центр перспективных технологий". Эритроцит в мазке на стеклянной подложке имеет форму дискоцита. Его радиус – 3600 нм, высота бортика – 460 нм, перепад от высшей точки до впадины – 35 нм. Это показано на профиле в точках установки первого и второго курсоров.
На рис.15 показаны эритроциты после пробоя импульсом с энергией 112 Дж. На увеличенном фрагменте красными и зелеными курсорами выделены линии измерения профиля пор, а на профилях красным пунктиром обозначены средние величины по поверхности. Левый профиль относится к левой, нижней поре, а правый – к правой, верхней. На первом профиле курсоры установлены в средней и нижней (самой глубокой) точке поры, что позволяет измерить ее глубину. На правом профиле показан диаметр поры – 93 нм и ее глубина – 14 нм.
Поверхность даже небольшого фрагмента мембраны эритроцита – не плоская. На ней присутствуют шероховатости, впадины, наклоны плоскости в разных направлениях. В структуре мембраны имеются также поры, которые могут быть возникать в результате неоднородности структуры или фазового перехода мембраны из жидко-кристаллического состояния в гель, так как температура крови в экспериментах составляла около 20°С, что ниже точки фазового перехода.
Другие биологические объекты
ЗМ позволяет также изучать ткани животных, поверхности костей и ногтей, структуру эмали зубов. Интересны возможности наблюдения поверхности листьев и стеблей живых растений. На рис.16 приведено трехмерное изображение фрагмента поверхности человеческого волоса. Любопытно заметить, что визуально лучше выглядящие волосы и на микро-
уровне имеют более совершенную структуру с меньшим количеством дефектов.
Все вышеизложенное касалось, в первую очередь, применений ЗМ для исследования морфологии поверхности биологических объектов, получения трехмерных изображений и определения размеров. Основные данные при изучении кинетики процессов – это цепочки меняющихся во времени трехмерных изображений, например, картины поверхности растущего кристалла.
Другой важный аспект ЗМ – измерение механических свойств биологических объектов. Эта информация нова для биологической науки, поэтому ее осмысление требует времени. ЗМ позволяет измерять механическую жесткость объекта, определять силу адгезии, регистрировать вариации коэффициента трения, получая трехмерную карту фрикционных свойств поверхности.
Прямые измерения ДНК (один ее конец прикреплен к подложке, другой связан с подвижным зондом АСМ) позволили оценить силу химической связи в одиночной биомакромолекуле. Двухцепочечная молекула ДНК разрывается при приложении силы в 10–10 Н. АСМ обеспечивает измерение динамики разворачивания одиночной белковой глобулы в линейную цепочку аминокислотных остатков. Сканирование бактериальных монослойных пленок показало, что бактерии Arthrobacter Globophormis в мумифицированной форме более хрупки, чем в вегетативном состоянии. Если обычные живые бактерии выдерживали силы до 10–6 Н, что на несколько порядков выше значений, традиционных для сканирования на воздухе, то мумифицированные бактерии при этих силах полностью разрушались.
Биологические сенсоры
АСМ изначально привлекала внимание возможностью создания уникальных биологических сенсоров. Вес одной бактерии – около 10–13 Н – обеспечивает дополнительный прогиб кантилевера с жесткостью 0,06 Н/м на 1,6·10–12 м, что находится на уровне предельного разрешения по силе микроскопа, работающего в контактном режиме. Однако, если использовать режим, когда кантилевер колеблется на резонансной частоте и она чувствительна к его массе, то можно измерить массу одной бактерии. По такому принципу строятся химические и биологические сенсоры.
Присоединившись к кантилеверу, масса реагента или биологического объекта изменяет частоту его резонансных колебаний [20]. Измерение сдвига частоты позволяет судить о массе адсорбированного вещества. Измерения массы наночастиц производятся, как правило, на специализированных атомных весах, в которых, как в АСМ, используется лазерно-оптическая система, но нет необходимости в кантилеверах с иглой. Ключевая деталь большинства весов – упругий элемент, причем здесь хорошо работает принцип: чем миниатюрнее весы, тем меньшие массы можно взвешивать. Используя этот подход, можно определить массу одной бактерии [21], белка [22] и даже отдельного атома [23].
Высокой чувствительностью обладают кантилеверы камертонного типа [24] и изготовленные из пьезоматериалов. Резонансные методы, как правило, обладают более высокой чувствительностью по сравнению со статическими. Поэтому весьма интересен тот факт, что именно статические биосенсоры весьма привлекательны для медицинских исследований [25]. Суть метода состоит в следующем:
поверхность одной из сторон кантилевера покрывается монослойной пленкой адсорбирующего вещества с определенным поверхностным натяжением;
при помещении такого кантилевера в биологическую жидкость на его поверхности может произойти специфическое связывание;
адсорбция материала на поверхности кантилевера приводит к изменению поверхностного натяжения пленки и его изгибу.
Для создания химических и биологических сенсоров используют кантилеверы с низкой механической жесткостью (рис.17) [26]. Если физический принцип их создания понятен, то биологические аспекты построения сенсора сложнее, так как необходимо биологически активное покрытие с биоспецифическим связыванием. Также желательно, чтобы биосенсор был пригоден для многократного использования, то есть при промывке восстанавливал функции адсорбции конкретного вещества. Таким образом, проблемы создания биосенсора находятся в основном в плоскости биологии, а не атомно-силовой микроскопии.
В целом можно отметить, что сканирующая ЗМ делает первые шаги в области биомедицинских и биосенсорных приложений. Сочетая ее с другими аналитическими методами, можно существенно продвинуться к персонифицированной медицине, которая должна учитывать на молекулярном уровне особенности строения каждого индивида.
Работа выполнена при поддержке ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009–2013 годы и ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы".
Литература
Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Scanning Probe Microscopy of DNA on Mica and Graphite. – AIP Conference Proceedings, No.696 (STM'03, Eindhoven University of Technology, July 21–25), p.452–456.
Галлямов М.О., Яминский И.В. Нуклеиновые кислоты. – Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров, сер. Сканирующая зондовая микроскопия, вып. 1, под ред. И.В. Яминского. Научный мир, 1997, с.25–40.
Галлямов М.О., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Яминский И.В. Конденсация ДНК Т4 в водно-спиртовых средах. – Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2000, №7, p.88–91.
Drygin Yu.F., Bordunova O.A., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. Atomic Force Microscopy Examination of TMV and Virion RNA. – FEBS Letters, 1998, 425, p.217–221.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of protein complexes. – Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications (Methods in Molecular Biology, vol. 242), Ed. by
P.C. Braga, D. Ricci. Humana Press, 2003,
p.217–230.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Yu., Dorokhov Y.L. and Atabekov J.G. Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro. – J. of General Virology, 2001, 82, p.1503–1508.
Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., McPherson A. In situ atomic force microscopy studies of surface morphology, growth kinetics, defect structure and dissolution in macromolecular crystallization. – J. of Crystal Growth, 1999, 196, p.471–488.
Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., Glantz W., McPherson A. Atomic force microscopy studies of surface morphology and growth kinetics in thaumatin crystallization. – J. Phys. Chem., 1996 , 100 (28), p.11736–11743.
Yaminsky I.V., Gvozdev N.V., Sil’nikova M.I., Rashkovich L.N. Atomic Force Microscopy Study of Lysozyme Crystallization. – Crystallography Reports, 2002, Vol.47, Suppl.1, p.S149–S158.
Гвоздев Н.В., Рашкович Л.Н., Яминский И.В. Атомно-силовая микроскопия грани (010) кристаллов ромбического лизоцима. – Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2000, № 8, с.73–77.
Malkin A.J., Land T.A., Kuznetsov Yu.G., McPherson A., DeYoreo J.J. Investigation of virus crystal growth mechanisms by in situ atomic force microscopy. – Phys. Rev. Lett., 1995, 75 (14),
p.2778–2781.
Kuznetsov Yu.G., Malkin A.J., Greenwood A., McPherson A. Interferometric studies of growth kinetics and surface morphology in macromolecular crystal growth: canavalin, thaumatin, and turnip yellow mosaic virus. – J. of Structural Biology, 1995, 114, p.184–196.
Дубровин Е.В., Кирикова М., Новиков В.К., Дрыгин Ю.Ф., Яминский И.В. Изучение особенностей адсорбции вируса табачной мозаики методом атомно-силовой микроскопии. – Коллоидный журнал, 2004, т.66, № 6, с.750–755.
Горелкин П., Калинина Н., Лав А., Макаров В., Тальянский М., Яминский И. Синтез наночастиц с использованием растений. Наноиндустрия, 2012, №7, с.16–22.
Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Yu, Lyubchenko Yu.L.,
Yaminsky I.V. Comparative studies of bacteria with atomic force microscopy operating in different modes. – Ultramicroscopy, 2001, 68 (1–2),
p.121–128.
Yaminsky I.V., Demin V.V., Bondarenko V.V. The differences in cellular surface of hybrid bacteria Escherichia coli K12, inheriting rfb-а3,4 gene of Shigella flexneri as revealed by atomic force microscopy. J. microbiology, epidemiology, and immunology, 1997, №6, p.15–18.
Боровик А.С., Тарасова О.С., Большакова А.В., Яминский И.В. Использование атомно-силовой микроскопии для изучения живых клеток. – Успехи современной биологии, 2000, 120(2),
p.217–224.
Kuznetsov Y.G., Malkin A.J., McPherson A. Atomic force microscopy studies of living cells: visualization of motility, division, aggregation, transformation, and apoptosis. – J. Struct. Biol., 1997, V.120, p.180–191.
Мороз В.В., Черныш А.М., Яминский И.В., Козлова Е.К., Киселев Г.А., Филонов А.С., Богушевич М.С., Гудкова О.Е. Перспективы применения методов атомной силовой микроскопии в реаниматологии. – Общая реаниматология, 2008, IV, 4, с.51–54.
Kiselev G.A., Yaminsky I.V. Scanning Probe Microscopy of Biomacromolecules: Instrumentation and Experiments. – Frontiers of Multifunctional Integrated Nanosystems, Ed. by E.Buzaneva, P.Schraff. Kluwer Academic, 2003, pp.221–228.
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M., Shen W., Carlson G., Foster J.S., Babcock K., Manalis S.R. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. – Nature, 2007, 446,
p.1066–1069.
Naik A.K., Hanay M.S., Hiebert W.K., Feng X.L., Roukes M.L. Towards single-molecule nanomechanical mass spectrometry. – Nature Nanotechnology, 2009, 4, p.445–450.
Jensen K., Kim K., Zettl A. An atomic-resolution nanomechanical mass sensor. – Nature Nanotechnology, 2008, 3, p.533–537.
Giessibl F.J. Principle of NC-AFM. – Noncontact atomic force microscopy, eds. S.Morita, R.Wiesendanger, E.Meyer, Springer, 2002,
p.211–246.
Hegner M., Arntz Y. Advanced biosensing using micromechanical cantilever arrays. – Methods in molecular biology, vol.242: Atomic force microscopy: Biomedical methods and applications. Ed. by P.C.Braga, D.Richi. Totowa, NJ: Humana Press, 2004, p.39–49.
Battiston F.M., Ramsteyer J.-P., Lang H.P., Baller M.K., Gerber Ch., Gimzewski G.K., Meyer E., Guntherodt H.-J. A chemical sensor based on a microfabricated cantilever array with simultaneous resonance – frequency and bending readout. – Sensors and Actuators B 77, 2001, p.122–131.
ДНК
При надежном закреплении ДНК на модифицированной поверхности графита она видна в отрицательном контрасте не как возвышение, что характерно для большинства объектов с конечной электропроводностью, а как углубление [1]. Хорошо воспроизводимые и информативные результаты (рис.1 и 2) были получены, когда для исследования ДНК применили АСМ и заимствованные из электронной микроскопии методы осаждения на поверхности слюды. В водном растворе ДНК и поверхность свежесколотой слюды имеют отрицательный заряд, поэтому между ними возникает кулоновское отталкивание. Для гашения отрицательного заряда необходимы растворы двухвалентных ионов. Хорошие результаты достигаются, когда слюда модифицируется небольшими концентрациями органических веществ: аминопропилтри-
этоксисиланом или силатраном. Такая поверхность дает незначительный фон, не препятствуя получению качественных изображений ДНК.
АСМ позволяет изучать конформационные состояния молекул ДНК в растворах [3]. Для оценки геометрии биомакромолекулы ее необходимо закрепить на подложке – тогда наблюдается конформация не свободно плавающей в растворе молекулы, а закрепленной на межфазной границе жидкость–твердое тело. При этом надо быть уверенным в минимальном воздействии подложки.
РНК
РНК – более сложный объект, чем ДНК, так как ее молекула менее жесткая и требует особенно деликатного обращения. В одном из первых наблюдений [4] для устранения возможных артефактов были последовательно рассмотрены РНК-содержащие вирусные частицы (вирус табачной мозаики), промежуточные стадии частичного разрушения белковой оболочки (рис.3), свободные концы РНК и момент освобождения молекул от белковой оболочки под действием мочевины. Полезную информацию для молекулярной биологии дали исследования комплексообразования РНК с различными белками, в частности транспортными.
Белки. Одиночные молекулы и комплексы
Размеры отдельных белковых молекул сравнимы с радиусом закругления зонда АСМ, поэтому субмолекулярное разрешение удается получать только при исследовании белков высокой молекулярной массы. Обеспечить упаковку цепей в небольших белках, например лизоциме (молекулярная масса 14 кД), пока не удавалось. При этом известны работы, где надежно отличались белковые мономеры от димеров и мультимеров (рис.4 [5]).
Зондовую микроскопию (ЗМ) можно использовать для регистрации специфического связывания антиген–антитело. Измерения размеров отдельных частиц и достигаемая точность позволяют отделить одиночные антитела и антигены от их комплексов. ЗМ дает возможность получить информацию о характере агрегирования белков и их связывания с нуклеиновыми кислотами. В [6], например, определен характер связывания транспортного белка с вирусной РНК (рис.5).
Белковые Кристаллы
Достоинством ЗМ при наблюдении белковых кристаллов в насыщенных растворах является возможность регистрации динамики процессов в жидких средах, естественных для многих биологических объектов. Исследования позволили зарегистрировать кинетику роста дислокационных холмов и двумерных зародышей многих белковых кристаллов на уровне отдельных молекул [7, 8]. Например, для лизоцима были измерены скорость движения ступеней и изломов, вероятность присоединения и отсоединения строительных единиц, зависимость кинетических параметров от таких факторов, как температура и пересыщение [9].
АСМ позволяет наблюдать структуру поверхности растущего кристалла с молекулярным разрешением и изучать упаковку молекул вблизи точечных дефектов, что недоступно для других методов. В [10] обнаружена реконструкция поверхности кристалла, когда упаковка белковых молекул на ней отличается от объемной структуры (рис.6 и 7).
Вирусы
Хотя по своему разрешению ЗМ проигрывает электронной микроскопии, большая легкость в приготовлении образцов оправдывает ее применение при исследовании вирусов для качественного анализа их морфологии. Основное применение ЗМ в вирусологии следует искать не в определении строения вирусов, а в изучении происходящих с ними процессов.
Процессы кристаллизации наблюдали для различных вирусов [11, 12]. Этапы разрушения белковой оболочки вируса табачной мозаики с освобождением РНК зарегистрированы в [4]. Поскольку АСМ позволяет измерять механические свойства наноструктур, для вирусных частиц определен модуль Юнга при их поперечном сжатии зондом: для вируса табачной мозаики он составляет от 3·109 до 4·109 Па, а для менее жесткого Х-вируса картофеля – 8·108 Па (рис.8). Хорошее соответствие экспериментам обеспечивают расчеты, основанные на модели деформации Герца (рис.9).
Вирус табачной мозаики можно использовать в качестве тестовой структуры [13] для калибровки Z-перемещения АСМ и как эталон жесткости (рис.10). Исследования показали, что вирусы могут быть средством доставки наночастиц в ткани человека. Также они нашли применение при экологически безопасном производстве наночастиц с использованием растений [14].
Бактериальные клетки
Бактерии можно считать практически идеальным объектом для ЗМ. Они имеют микронные размеры, поэтому можно наблюдать отдельные клетки и их колонии, а также изучать фрагменты клеток [2]. Бактериальные клетки имеют жесткий полимерный каркас и не деформируются при сканировании зондом микроскопа. Для наблюдения бактерий на воздухе выращенные в питательной среде клетки переносятся в дистиллированную воду до концентрации около 109/мл (краткосрочное пребывание в воде не приводит к разрушению бактерий). Капля в несколько мкл помещается на свежесколотую слюду, и вода смачивает ее, образуя тонкую пленку, после удаления которой одиночные клетки осаждаются на подложке или формируют монослойные покрытия.
АСМ позволяет получать трехмерные изображения клеток бактерий (рис.11). Эти данные могут служить дополнительным критерием при составлении определителей бактерий. При наблюдении в жидкости контраст изображений падает, что объясняется наличием подвижных полимерных цепей наружной мембраны. На рис.12 приведено изображение бактериальных клеток E.coli в буферном растворе [15].
АСМ дает возможность надежно регистрировать структурные изменения на поверхности наружной мембраны клеточной стенки. На рис.13 изображена родительская бактерия Escherichia coli и генно- модифицированная бактерия, в исходную ДНК которой вставлен ген rfb-a3,4, отвечающий за синтез О-специфических боковых цепей липополисахаридов. Эти цепи создают на поверхности клетки ламелярную структуру, по морфологии существенно отличающуюся от поверхности родительской клетки [16].
Клетки высших организмов
Клетки высших организмов – животных и растений – не обладают высокой жесткостью, поэтому взаимодействие с зондом приводит к их деформации и увеличению площади контакта зонда с поверхностью клетки, что снижает пространственное разрешение [17]. С другой стороны, ЗМ дает возможность измерять не только механическую жесткость отдельных клеток, но и их адгезивные и фрикционные свойства.
ЗМ позволяет наблюдать динамические процессы, происходящие с клетками. Например, визуализировано движение остеобластов мышей по поверхности стеклянной подложки [18]; образование агрегатов этих клеток и агрегация фибробластов куриных эмбрионов; получены АСМ-изображения первичных остеобластов мышей при клеточном делении; исследованы изменения клеточной поверхности, сопутствующие апоптозу клеток остеосаркомы. Сканирование поверхности клеток острием зонда позволяет визуализировать некоторые детали их внутреннего строения. Так, на поверхности клетки можно различить под мембраной элементы цитоскелета, а на снимке делящегося остеобласта отчетливо видно раздваивающееся клеточное ядро.
Помимо морфологического анализа с нанометровым разрешением, возможно определение механических параметров мембраны клеток и нахождение с помощью оптических меток расположения клеточных рецепторов. Также ЗМ может применяться для диагностических целей, например, в реаниматологии [19].
Авторы впервые прямым методом показали характер повреждения (образование нанопор) стенок эритроцита при электропорации различной интенсивности. Исследования проводились на венозной крови человека. Кровь (1,2 мл) помещалась в кварцевую кювету с титановыми электродами, расстояние между которыми составляло 15 мм. На электроды подавался импульс электрического поля. В качестве источника калиброванного поля использовался клинический дефибриллятор Lifepak 7 (США). При напряженности поля E в растворе 1100 В/см и длительности импульса 10 мс наведенный трансмембранный потенциал превышал пороговый потенциал пробоя мембраны (φпор = 300÷500 мВ), и происходила их необратимая электропорация.
Уменьшение числа эритроцитов вследствие гемолиза, а следовательно, электропорация, оценивалось по кинетической кривой – зависимости D(t), где D – оптическая плотность суспензии крови. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов описывались экспоненциальной функцией:
D(t) = D0exp(–βt) + D1,
где β – константа скорости уменьшения числа эритроцитов, D1 – остаточный уровень клеток, D0 – начальное число эритроцитов. Исследование поверхности эритроцитов до и после воздействия электрического поля проводилось на мазках крови по стандартной методике при комнатной температуре.
Изображения поверхности мембран (рис.14) были получены на кафедре полимеров и кристаллов физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова с помощью атомного силового микроскопа "ФемтоСкан", разработанного НПП "Центр перспективных технологий". Эритроцит в мазке на стеклянной подложке имеет форму дискоцита. Его радиус – 3600 нм, высота бортика – 460 нм, перепад от высшей точки до впадины – 35 нм. Это показано на профиле в точках установки первого и второго курсоров.
На рис.15 показаны эритроциты после пробоя импульсом с энергией 112 Дж. На увеличенном фрагменте красными и зелеными курсорами выделены линии измерения профиля пор, а на профилях красным пунктиром обозначены средние величины по поверхности. Левый профиль относится к левой, нижней поре, а правый – к правой, верхней. На первом профиле курсоры установлены в средней и нижней (самой глубокой) точке поры, что позволяет измерить ее глубину. На правом профиле показан диаметр поры – 93 нм и ее глубина – 14 нм.
Поверхность даже небольшого фрагмента мембраны эритроцита – не плоская. На ней присутствуют шероховатости, впадины, наклоны плоскости в разных направлениях. В структуре мембраны имеются также поры, которые могут быть возникать в результате неоднородности структуры или фазового перехода мембраны из жидко-кристаллического состояния в гель, так как температура крови в экспериментах составляла около 20°С, что ниже точки фазового перехода.
Другие биологические объекты
ЗМ позволяет также изучать ткани животных, поверхности костей и ногтей, структуру эмали зубов. Интересны возможности наблюдения поверхности листьев и стеблей живых растений. На рис.16 приведено трехмерное изображение фрагмента поверхности человеческого волоса. Любопытно заметить, что визуально лучше выглядящие волосы и на микро-
уровне имеют более совершенную структуру с меньшим количеством дефектов.
Все вышеизложенное касалось, в первую очередь, применений ЗМ для исследования морфологии поверхности биологических объектов, получения трехмерных изображений и определения размеров. Основные данные при изучении кинетики процессов – это цепочки меняющихся во времени трехмерных изображений, например, картины поверхности растущего кристалла.
Другой важный аспект ЗМ – измерение механических свойств биологических объектов. Эта информация нова для биологической науки, поэтому ее осмысление требует времени. ЗМ позволяет измерять механическую жесткость объекта, определять силу адгезии, регистрировать вариации коэффициента трения, получая трехмерную карту фрикционных свойств поверхности.
Прямые измерения ДНК (один ее конец прикреплен к подложке, другой связан с подвижным зондом АСМ) позволили оценить силу химической связи в одиночной биомакромолекуле. Двухцепочечная молекула ДНК разрывается при приложении силы в 10–10 Н. АСМ обеспечивает измерение динамики разворачивания одиночной белковой глобулы в линейную цепочку аминокислотных остатков. Сканирование бактериальных монослойных пленок показало, что бактерии Arthrobacter Globophormis в мумифицированной форме более хрупки, чем в вегетативном состоянии. Если обычные живые бактерии выдерживали силы до 10–6 Н, что на несколько порядков выше значений, традиционных для сканирования на воздухе, то мумифицированные бактерии при этих силах полностью разрушались.
Биологические сенсоры
АСМ изначально привлекала внимание возможностью создания уникальных биологических сенсоров. Вес одной бактерии – около 10–13 Н – обеспечивает дополнительный прогиб кантилевера с жесткостью 0,06 Н/м на 1,6·10–12 м, что находится на уровне предельного разрешения по силе микроскопа, работающего в контактном режиме. Однако, если использовать режим, когда кантилевер колеблется на резонансной частоте и она чувствительна к его массе, то можно измерить массу одной бактерии. По такому принципу строятся химические и биологические сенсоры.
Присоединившись к кантилеверу, масса реагента или биологического объекта изменяет частоту его резонансных колебаний [20]. Измерение сдвига частоты позволяет судить о массе адсорбированного вещества. Измерения массы наночастиц производятся, как правило, на специализированных атомных весах, в которых, как в АСМ, используется лазерно-оптическая система, но нет необходимости в кантилеверах с иглой. Ключевая деталь большинства весов – упругий элемент, причем здесь хорошо работает принцип: чем миниатюрнее весы, тем меньшие массы можно взвешивать. Используя этот подход, можно определить массу одной бактерии [21], белка [22] и даже отдельного атома [23].
Высокой чувствительностью обладают кантилеверы камертонного типа [24] и изготовленные из пьезоматериалов. Резонансные методы, как правило, обладают более высокой чувствительностью по сравнению со статическими. Поэтому весьма интересен тот факт, что именно статические биосенсоры весьма привлекательны для медицинских исследований [25]. Суть метода состоит в следующем:
поверхность одной из сторон кантилевера покрывается монослойной пленкой адсорбирующего вещества с определенным поверхностным натяжением;
при помещении такого кантилевера в биологическую жидкость на его поверхности может произойти специфическое связывание;
адсорбция материала на поверхности кантилевера приводит к изменению поверхностного натяжения пленки и его изгибу.
Для создания химических и биологических сенсоров используют кантилеверы с низкой механической жесткостью (рис.17) [26]. Если физический принцип их создания понятен, то биологические аспекты построения сенсора сложнее, так как необходимо биологически активное покрытие с биоспецифическим связыванием. Также желательно, чтобы биосенсор был пригоден для многократного использования, то есть при промывке восстанавливал функции адсорбции конкретного вещества. Таким образом, проблемы создания биосенсора находятся в основном в плоскости биологии, а не атомно-силовой микроскопии.
В целом можно отметить, что сканирующая ЗМ делает первые шаги в области биомедицинских и биосенсорных приложений. Сочетая ее с другими аналитическими методами, можно существенно продвинуться к персонифицированной медицине, которая должна учитывать на молекулярном уровне особенности строения каждого индивида.
Работа выполнена при поддержке ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009–2013 годы и ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы".
Литература
Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Scanning Probe Microscopy of DNA on Mica and Graphite. – AIP Conference Proceedings, No.696 (STM'03, Eindhoven University of Technology, July 21–25), p.452–456.
Галлямов М.О., Яминский И.В. Нуклеиновые кислоты. – Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров, сер. Сканирующая зондовая микроскопия, вып. 1, под ред. И.В. Яминского. Научный мир, 1997, с.25–40.
Галлямов М.О., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Яминский И.В. Конденсация ДНК Т4 в водно-спиртовых средах. – Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2000, №7, p.88–91.
Drygin Yu.F., Bordunova O.A., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. Atomic Force Microscopy Examination of TMV and Virion RNA. – FEBS Letters, 1998, 425, p.217–221.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of protein complexes. – Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications (Methods in Molecular Biology, vol. 242), Ed. by
P.C. Braga, D. Ricci. Humana Press, 2003,
p.217–230.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Yu., Dorokhov Y.L. and Atabekov J.G. Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro. – J. of General Virology, 2001, 82, p.1503–1508.
Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., McPherson A. In situ atomic force microscopy studies of surface morphology, growth kinetics, defect structure and dissolution in macromolecular crystallization. – J. of Crystal Growth, 1999, 196, p.471–488.
Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., Glantz W., McPherson A. Atomic force microscopy studies of surface morphology and growth kinetics in thaumatin crystallization. – J. Phys. Chem., 1996 , 100 (28), p.11736–11743.
Yaminsky I.V., Gvozdev N.V., Sil’nikova M.I., Rashkovich L.N. Atomic Force Microscopy Study of Lysozyme Crystallization. – Crystallography Reports, 2002, Vol.47, Suppl.1, p.S149–S158.
Гвоздев Н.В., Рашкович Л.Н., Яминский И.В. Атомно-силовая микроскопия грани (010) кристаллов ромбического лизоцима. – Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2000, № 8, с.73–77.
Malkin A.J., Land T.A., Kuznetsov Yu.G., McPherson A., DeYoreo J.J. Investigation of virus crystal growth mechanisms by in situ atomic force microscopy. – Phys. Rev. Lett., 1995, 75 (14),
p.2778–2781.
Kuznetsov Yu.G., Malkin A.J., Greenwood A., McPherson A. Interferometric studies of growth kinetics and surface morphology in macromolecular crystal growth: canavalin, thaumatin, and turnip yellow mosaic virus. – J. of Structural Biology, 1995, 114, p.184–196.
Дубровин Е.В., Кирикова М., Новиков В.К., Дрыгин Ю.Ф., Яминский И.В. Изучение особенностей адсорбции вируса табачной мозаики методом атомно-силовой микроскопии. – Коллоидный журнал, 2004, т.66, № 6, с.750–755.
Горелкин П., Калинина Н., Лав А., Макаров В., Тальянский М., Яминский И. Синтез наночастиц с использованием растений. Наноиндустрия, 2012, №7, с.16–22.
Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Yu, Lyubchenko Yu.L.,
Yaminsky I.V. Comparative studies of bacteria with atomic force microscopy operating in different modes. – Ultramicroscopy, 2001, 68 (1–2),
p.121–128.
Yaminsky I.V., Demin V.V., Bondarenko V.V. The differences in cellular surface of hybrid bacteria Escherichia coli K12, inheriting rfb-а3,4 gene of Shigella flexneri as revealed by atomic force microscopy. J. microbiology, epidemiology, and immunology, 1997, №6, p.15–18.
Боровик А.С., Тарасова О.С., Большакова А.В., Яминский И.В. Использование атомно-силовой микроскопии для изучения живых клеток. – Успехи современной биологии, 2000, 120(2),
p.217–224.
Kuznetsov Y.G., Malkin A.J., McPherson A. Atomic force microscopy studies of living cells: visualization of motility, division, aggregation, transformation, and apoptosis. – J. Struct. Biol., 1997, V.120, p.180–191.
Мороз В.В., Черныш А.М., Яминский И.В., Козлова Е.К., Киселев Г.А., Филонов А.С., Богушевич М.С., Гудкова О.Е. Перспективы применения методов атомной силовой микроскопии в реаниматологии. – Общая реаниматология, 2008, IV, 4, с.51–54.
Kiselev G.A., Yaminsky I.V. Scanning Probe Microscopy of Biomacromolecules: Instrumentation and Experiments. – Frontiers of Multifunctional Integrated Nanosystems, Ed. by E.Buzaneva, P.Schraff. Kluwer Academic, 2003, pp.221–228.
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M., Shen W., Carlson G., Foster J.S., Babcock K., Manalis S.R. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. – Nature, 2007, 446,
p.1066–1069.
Naik A.K., Hanay M.S., Hiebert W.K., Feng X.L., Roukes M.L. Towards single-molecule nanomechanical mass spectrometry. – Nature Nanotechnology, 2009, 4, p.445–450.
Jensen K., Kim K., Zettl A. An atomic-resolution nanomechanical mass sensor. – Nature Nanotechnology, 2008, 3, p.533–537.
Giessibl F.J. Principle of NC-AFM. – Noncontact atomic force microscopy, eds. S.Morita, R.Wiesendanger, E.Meyer, Springer, 2002,
p.211–246.
Hegner M., Arntz Y. Advanced biosensing using micromechanical cantilever arrays. – Methods in molecular biology, vol.242: Atomic force microscopy: Biomedical methods and applications. Ed. by P.C.Braga, D.Richi. Totowa, NJ: Humana Press, 2004, p.39–49.
Battiston F.M., Ramsteyer J.-P., Lang H.P., Baller M.K., Gerber Ch., Gimzewski G.K., Meyer E., Guntherodt H.-J. A chemical sensor based on a microfabricated cantilever array with simultaneous resonance – frequency and bending readout. – Sensors and Actuators B 77, 2001, p.122–131.
Отзывы читателей
