eng
Выпуск #2/2014
Е.Дубровин, Г.Мешков, И.Яминский
Наблюдение вируса табачной мозаики в практикуме сканирующей зондовой микроскопии
Наблюдение вируса табачной мозаики в практикуме сканирующей зондовой микроскопии
Просмотры: 6170
Успешное развитие технологий нередко шло по пути подражания природным объектам и процессам, получившего название биомимикрии. Разумеется, и в нанотехнологиях биомимикрия имеет большой потенциал. Одним из наиболее простых (с точки зрения строения) природных объектов, размеры которых лежат в нанометровом диапазоне, являются вирусы.
Теги: atomic-force microscopy research of the surface topography sample preparation атомно-силовая микроскопия исследование топографии поверхности пробоподготовка
Вирус (от лат. virus – яд) – микроскопическая частица, способная инфицировать клетки живых организмов. Вирусы являются облигатными паразитами – они не способны размножаться вне клетки. В настоящее время известны вирусы, размножающиеся в клетках растений, животных, грибов и бактерий (последних обычно называют бактериофагами). Вирусные частицы (вирионы) представляют собой белковую капсулу – капсид, содержащую геном вируса, представленный одной или несколькими молекулами ДНК или РНК. Капсид построен из капсомеров — белковых комплексов, состоящих, в свою очередь, из протомеров. Нуклеиновая кислота в комплексе с белками обозначается термином нуклеокапсид. Некоторые вирусы имеют также внешнюю липидную оболочку. Размеры различных вирусов колеблются от 20 до 500 и более нанометров. Вирионы часто имеют правильную геометрическую форму (икосаэдр, цилиндр), встречаются также и более сложные структуры (рис.1–3).
Первый известный вирус – ВТМ – был выделен русским исследователем Дмитрием Ивановским в 1882 году и более подробно изучен голландским ученым Мартинусом Бейжеринком в 1898 году. В настоящее время описано более 5000 типов вирусов. Вирусы являются одной из самых распространенных по численности форм существования органической материи на планете: воды мирового океана содержат колоссальное количество бактериофагов (около 1011 частиц на миллилитр воды).
Роль вирусов в биологии
и их использование человеком
Вирусы имеют генетические связи с представителями флоры и фауны Земли. Согласно последним исследованиям, геном человека более чем на 30% состоит из информации, кодируемой вирус-подобными элементами. С помощью вирусов может происходить так называемый горизонтальный перенос генов, т.е. передача генетической информации не от отца к сыну и т.д., а между двумя неродственными (или даже относящимися к разным видам) особями. Благодаря этому свойству вирусы вносят существенный вклад в биологическую эволюцию планеты.
Вирусы используют в молекулярной и клеточной биологии, так как с их участием можно создавать простые системы для изучения функций клеток. Например, использование вирусов помогло в понимании основных механизмов молекулярной генетики и иммунологии. Вирусы широко используют как переносчики генов в генной инженерии, и в частности при создании генетически модифицированных организмов (например, вирус мозаики цветной капусты). Лечение инфекционных болезней с помощью бактериофагов – фаговая терапия – активно развивается в последнее время, поскольку является альтернативой антибиотикам, имеющим побочные эффекты и низкую эффективность из-за приспосабливаемости бактерий к ним.
Вирусы являются многообещающим объектом для развития нанотехнологий (впрочем, применения, описанные выше, можно также отнести к этому виду технологий). С точки зрения науки о материалах вирусы являются органическими наночастицами, которые умеют проникать через стенки клеток-хозяев. Размеры и форма вирусов, а также количество и природа функциональных групп на их поверхности точно определены, благодаря чему вирусы можно использовать как шаблоны для организации материала на наномасштабе. Например, частицы вируса мозаики вигны (CPMV) были применены для усиления сигнала биосенсора, основанного на ДНК-матрице. В этой работе вирусными частицами разделяли флуоресцентные красители, чтобы препятствовать возникновению нефлуоресцентных димеров, которые действуют как тушители [1]. Другим примером является применение CPMV в качестве наномакета для молекулярной электроники [2]. Палочковидные вирусы, покрытые металлическими наночастицами или проводящими полимерами, например полианилином, используют для создания нанопроводов и новых проводящих материалов.
Строение и состав ВТМ
ВТМ – классический объект вирусологии. Он вызывает мозаичную болезнь табака, которая проявляется как пятнистость листьев. Вирус представляет собой палочки диаметром 18 нм и длиной 300 нм (рис.1), состоящие из белка и РНК [3]. Молекула РНК длиной в 6390 нуклеотидных оснований имеет вид спирали с длиной витка 2,3 нм, а оболочка сформирована из 2130 белковых субъединиц. Белок оболочки самоорганизуется в палочковидную спиральную структуру (16,3 мономерного белка на один поворот спирали) вокруг РНК, которая расположена в цилиндрическом кольце радиусом около 6 нм и недоступна для воздействия клеточных энзимов, ее разрушающих. Электронные микрофотографии показывают наличие в вирионах внутреннего канала диаметром около 4 нм. ВТМ является термостабильным вирусом: он может выдерживать температуры до 500°С в течение 30 мин. Современная вирусология обязана этому вирусу не только своим рождением, но и основными концепциями, которые складываются до настоящего времени, поэтому его дальнейшее изучение, особенно с помощью новых методов, актуально по сей день.
Для чего необходима атомно-силовая микроскопия вирусных частиц?
При АСМ-исследовании топографии поверхности вирусов в режимах постоянного или
прерывистого контакта можно изучать следующие аспекты: морфологию частиц, особенности адсорбции вирусных частиц на поверхность (кинетику адсорбции, степень адгезии, взаимную ориентацию частиц на поверхности [4–6]), зависимость адсорбции от вида поверхности (например, при модификации подложки различными химическими соединениями [5]), процессы кристаллизации вирусных частиц на поверхности [7], механическую прочность вирионов и отдельных белковых субъ-
единиц [8], локализацию генома внутри вирионов [9]. Также могут изучаться такие процессы, как одевание-раздевание вирусных частиц [10], высвобождение РНК (ДНК) из частиц [4], взаимодействие с клеткой-хозяином.
Примеры АСМ-изображений шести типов вирусов приведены на рис.2. На рис.3 показано АСМ-изображение, на котором видна адсорбция бактериофагов на поверхность клетки Escherichia coli. АСМ позволяет также манипулировать отдельными вирусными частицами с помощью кантилевера и создавать заданную архитектуру в наномасштабе. Кроме того, в режимах АСМ-спектроскопии (снятие силовых кривых, т.е. зависимости силы, действующей со стороны кантилевера на образец, от вертикального положения пьезосканера) появляются дополнительные возможности количественно изучать силу взаимодействия вириона с подложкой, РНК (ДНК) с белковой оболочкой, белковых субъединиц между собой.
АСМ позволяет получать уникальную информацию об исследуемом образце. Чрезвычайно важно, что в АСМ можно исследовать вирусные частицы без дополнительного контрастирования атомами тяжелых металлов (как это необходимо, например, для электронной микроскопии). Можно получать трехмерную топографию с высоким разрешением (типичное разрешение для мягких объектов: доли нанометров для латерального и доли ангстрем для вертикального направлений), изучать живые объекты на поверхности, как в воздушных, так и в водных средах. Информация, получаемая с помощью АСМ, требуется как для фундаментальной науки, так и для развития нанотехнологий.
ВТМ неоднократно исследовали с помощью АСМ [4, 5, 11–13]. В частности, была отмечена более высокая адсорбционная способность вирусных частиц на поверхности высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) по сравнению с поверхностью слюды [4], что объяснялось гидрофобными взаимодействиями частиц с подложкой. В этой работе после обработки вирионов ВТМ диметилсульфоксидом или мочевиной наблюдали "раздевание" вирусной частицы и выход из нее молекулы РНК. Более подробное изучение адсорбции частиц ВТМ на поверхностях, модифицированных различными химическими соединениями, показало высокую чувствительность процесса адсорбции к природе модификатора [5]. Например, модификация слюды бромистым цетилтриметиламмонием повысила адгезию ВТМ на слюду более чем в 10 раз. Следует отметить, что при изучении ВТМ на таких подложках, как слюда или графит, мы имеем дело с физической адсорбцией вирионов на поверхности, т.е. адсорбцией прежде всего за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий (и гидрофобных для поверхности графита).
Приготовление образцов ВТМ для АСМ
Типичная процедура приготовления образца ВТМ для исследования с помощью АСМ описана в [5].
Перед нанесением на подложки для АСМ аликвоту раствора вируса центрифугировали при 13000 об./мин на центрифуге Eppendorf 5415С, разводили фосфатным буфером (5 мМ фосфата натрия, рН 7.3, 150 мМ NaCl) до концентрации 1,3 мг/мл для слюды или до 0,325 мг/мл для графита. Пять микролитров образца наносили на свежий скол слюды или ВОПГ и выдерживали во влажной камере в течение 30 мин на слюде или 15 мин – на графите. Сорбированные образцы вируса 2–3 раза промывали тридистиллированной водой и высушивали в вакуум-эксикаторе.
Получение и обработка
АСМ-изображений образца ВТМ
Получить изображение образца ВТМ можно в резонансном режиме. В практикуме сканирующей зондовой микроскопии МГУ им. М.В.Ломоносова мы используем атомно-силовые микроскопы "ФемтоСкан". Для обработки данных используется программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [14, 15]. Программное обеспечение со сроком действия в 1 месяц можно скачать на сайтах www.nanoscopy.ru и
www.nanoscopy.net [15].
В этом ПО командой Distance контекстного меню проводится измерение длин вирусных частиц и построение гистограммы распределения по длинам. Измеренные частицы удобно помечать маркерами, используя команду контекстного меню Marks. При анализе изображений можно найти наиболее вероятное значение длины вирусных частиц и оценить дисперсию получившегося распределения.
Работа учащегося практикума сканирующей зондовой микроскопии помогает ему освоить как теоретический материал, так и адекватно интерпретировать полученные результаты [16].
Литература
Soto C.M., Blum A.S., Vora G.J., et al. Fluorescent signal amplification of carbocyanine dyes using engineered viral nanoparticles. –
J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 5184–5189.
Blum A.S., Soto C.M., Wilson C.D., et al. An engineered virus as a scaffold for three-dimensional self-assembly on the nanoscale. – Small, 2005, 7, 702–706.
The Universal Virus Database.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/.
Drygin Y.F., Bordunova O.A., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy examination of TMV and virion RNA. – FEBS Lett., 1998, 425, 217–221.
Дубровин Е.В., Кирикова М.Н., Новиков В.К., Дрыгин Ю.Ф., Яминский И.В. Изучение особенностей адгезии вируса табачной мозаики методом атомно-силовой микроскопии. – Коллоидный журнал, 2004, 66, 750–755.
Образцова Е.А., Калинина Н.О., Тальянский М.Е., Габренайте-Верховская Р., Макинен К., Яминский И.В. Атомно-силовая микроскопия А-вируса картофеля. – Коллоидный журнал, 2008, 70, 199–201.
Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., Lucas R.W., McPherson A. Surface processes in the crystallization of turnip yellow mosaic virus visualized by atomic force microscopy. –
J. Struct. Biol., 1999, 127, 35–43.
Roos W.H., Ivanovska I.L., Evilevitch A., Wuite G.J.L. Viral capsids: Mechanical characteristics, genome packaging and delivery mechanisms. – Cell. Mol. Life Sci., 2007, 64, 1484–1497.
Matsko N., Klinov D., Manykin A., Demin V., Klimenko S. Atomic force microscopy analysis of bacteriophages φKZ and T4. – J. Electron Microsc., 2001, 50, 417–422.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., Tabekov J.G. AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. – J. Mol. Biol., 2003, 332, 321–325.
Falvo M.R., Washburn S., Superfine R., Finch M., Brooks F.P. Jr., Chi V., Taylor R.M. Manipulation of individual viruses: Friction and mechanical properties. – Biophys. J., 1997, 72, 1396–1403.
Britt D.W., Buijs J., Hlady V. Tobacco mosaic virus adsorption on self-assembled and Langmuir–Blodgett monolayers studied by TIRF and SFM. – Thin Solid Films, 1998, 327–329, 824–828.
Maeda H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. – Langmuir, 1997, 13, 4150–4161.
Руководство пользователя пакета программного обеспечения для управления сканирующим зондовым микроскопом и обработки изображений. http://www.rusnanonet.ru/download/equipment/fsonline_manual.pdf.
ФемтоСкан Онлайн,
http://www.nanoscopy.net/en/femtoscan-d.php.
Дубровин Е.В., Мешков Г.Б., Яминский И.В. Сканирующая зондовая микроскопия: получение трехмерных изображений. Начальное знакомство с методом исследования поверхности материалов и нанообъектов. Учебное пособие. Описание задачи лабораторного практикума. – М.: МГУ им. М.В.Ломоносова, 2009.
Первый известный вирус – ВТМ – был выделен русским исследователем Дмитрием Ивановским в 1882 году и более подробно изучен голландским ученым Мартинусом Бейжеринком в 1898 году. В настоящее время описано более 5000 типов вирусов. Вирусы являются одной из самых распространенных по численности форм существования органической материи на планете: воды мирового океана содержат колоссальное количество бактериофагов (около 1011 частиц на миллилитр воды).
Роль вирусов в биологии
и их использование человеком
Вирусы имеют генетические связи с представителями флоры и фауны Земли. Согласно последним исследованиям, геном человека более чем на 30% состоит из информации, кодируемой вирус-подобными элементами. С помощью вирусов может происходить так называемый горизонтальный перенос генов, т.е. передача генетической информации не от отца к сыну и т.д., а между двумя неродственными (или даже относящимися к разным видам) особями. Благодаря этому свойству вирусы вносят существенный вклад в биологическую эволюцию планеты.
Вирусы используют в молекулярной и клеточной биологии, так как с их участием можно создавать простые системы для изучения функций клеток. Например, использование вирусов помогло в понимании основных механизмов молекулярной генетики и иммунологии. Вирусы широко используют как переносчики генов в генной инженерии, и в частности при создании генетически модифицированных организмов (например, вирус мозаики цветной капусты). Лечение инфекционных болезней с помощью бактериофагов – фаговая терапия – активно развивается в последнее время, поскольку является альтернативой антибиотикам, имеющим побочные эффекты и низкую эффективность из-за приспосабливаемости бактерий к ним.
Вирусы являются многообещающим объектом для развития нанотехнологий (впрочем, применения, описанные выше, можно также отнести к этому виду технологий). С точки зрения науки о материалах вирусы являются органическими наночастицами, которые умеют проникать через стенки клеток-хозяев. Размеры и форма вирусов, а также количество и природа функциональных групп на их поверхности точно определены, благодаря чему вирусы можно использовать как шаблоны для организации материала на наномасштабе. Например, частицы вируса мозаики вигны (CPMV) были применены для усиления сигнала биосенсора, основанного на ДНК-матрице. В этой работе вирусными частицами разделяли флуоресцентные красители, чтобы препятствовать возникновению нефлуоресцентных димеров, которые действуют как тушители [1]. Другим примером является применение CPMV в качестве наномакета для молекулярной электроники [2]. Палочковидные вирусы, покрытые металлическими наночастицами или проводящими полимерами, например полианилином, используют для создания нанопроводов и новых проводящих материалов.
Строение и состав ВТМ
ВТМ – классический объект вирусологии. Он вызывает мозаичную болезнь табака, которая проявляется как пятнистость листьев. Вирус представляет собой палочки диаметром 18 нм и длиной 300 нм (рис.1), состоящие из белка и РНК [3]. Молекула РНК длиной в 6390 нуклеотидных оснований имеет вид спирали с длиной витка 2,3 нм, а оболочка сформирована из 2130 белковых субъединиц. Белок оболочки самоорганизуется в палочковидную спиральную структуру (16,3 мономерного белка на один поворот спирали) вокруг РНК, которая расположена в цилиндрическом кольце радиусом около 6 нм и недоступна для воздействия клеточных энзимов, ее разрушающих. Электронные микрофотографии показывают наличие в вирионах внутреннего канала диаметром около 4 нм. ВТМ является термостабильным вирусом: он может выдерживать температуры до 500°С в течение 30 мин. Современная вирусология обязана этому вирусу не только своим рождением, но и основными концепциями, которые складываются до настоящего времени, поэтому его дальнейшее изучение, особенно с помощью новых методов, актуально по сей день.
Для чего необходима атомно-силовая микроскопия вирусных частиц?
При АСМ-исследовании топографии поверхности вирусов в режимах постоянного или
прерывистого контакта можно изучать следующие аспекты: морфологию частиц, особенности адсорбции вирусных частиц на поверхность (кинетику адсорбции, степень адгезии, взаимную ориентацию частиц на поверхности [4–6]), зависимость адсорбции от вида поверхности (например, при модификации подложки различными химическими соединениями [5]), процессы кристаллизации вирусных частиц на поверхности [7], механическую прочность вирионов и отдельных белковых субъ-
единиц [8], локализацию генома внутри вирионов [9]. Также могут изучаться такие процессы, как одевание-раздевание вирусных частиц [10], высвобождение РНК (ДНК) из частиц [4], взаимодействие с клеткой-хозяином.
Примеры АСМ-изображений шести типов вирусов приведены на рис.2. На рис.3 показано АСМ-изображение, на котором видна адсорбция бактериофагов на поверхность клетки Escherichia coli. АСМ позволяет также манипулировать отдельными вирусными частицами с помощью кантилевера и создавать заданную архитектуру в наномасштабе. Кроме того, в режимах АСМ-спектроскопии (снятие силовых кривых, т.е. зависимости силы, действующей со стороны кантилевера на образец, от вертикального положения пьезосканера) появляются дополнительные возможности количественно изучать силу взаимодействия вириона с подложкой, РНК (ДНК) с белковой оболочкой, белковых субъединиц между собой.
АСМ позволяет получать уникальную информацию об исследуемом образце. Чрезвычайно важно, что в АСМ можно исследовать вирусные частицы без дополнительного контрастирования атомами тяжелых металлов (как это необходимо, например, для электронной микроскопии). Можно получать трехмерную топографию с высоким разрешением (типичное разрешение для мягких объектов: доли нанометров для латерального и доли ангстрем для вертикального направлений), изучать живые объекты на поверхности, как в воздушных, так и в водных средах. Информация, получаемая с помощью АСМ, требуется как для фундаментальной науки, так и для развития нанотехнологий.
ВТМ неоднократно исследовали с помощью АСМ [4, 5, 11–13]. В частности, была отмечена более высокая адсорбционная способность вирусных частиц на поверхности высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) по сравнению с поверхностью слюды [4], что объяснялось гидрофобными взаимодействиями частиц с подложкой. В этой работе после обработки вирионов ВТМ диметилсульфоксидом или мочевиной наблюдали "раздевание" вирусной частицы и выход из нее молекулы РНК. Более подробное изучение адсорбции частиц ВТМ на поверхностях, модифицированных различными химическими соединениями, показало высокую чувствительность процесса адсорбции к природе модификатора [5]. Например, модификация слюды бромистым цетилтриметиламмонием повысила адгезию ВТМ на слюду более чем в 10 раз. Следует отметить, что при изучении ВТМ на таких подложках, как слюда или графит, мы имеем дело с физической адсорбцией вирионов на поверхности, т.е. адсорбцией прежде всего за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий (и гидрофобных для поверхности графита).
Приготовление образцов ВТМ для АСМ
Типичная процедура приготовления образца ВТМ для исследования с помощью АСМ описана в [5].
Перед нанесением на подложки для АСМ аликвоту раствора вируса центрифугировали при 13000 об./мин на центрифуге Eppendorf 5415С, разводили фосфатным буфером (5 мМ фосфата натрия, рН 7.3, 150 мМ NaCl) до концентрации 1,3 мг/мл для слюды или до 0,325 мг/мл для графита. Пять микролитров образца наносили на свежий скол слюды или ВОПГ и выдерживали во влажной камере в течение 30 мин на слюде или 15 мин – на графите. Сорбированные образцы вируса 2–3 раза промывали тридистиллированной водой и высушивали в вакуум-эксикаторе.
Получение и обработка
АСМ-изображений образца ВТМ
Получить изображение образца ВТМ можно в резонансном режиме. В практикуме сканирующей зондовой микроскопии МГУ им. М.В.Ломоносова мы используем атомно-силовые микроскопы "ФемтоСкан". Для обработки данных используется программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [14, 15]. Программное обеспечение со сроком действия в 1 месяц можно скачать на сайтах www.nanoscopy.ru и
www.nanoscopy.net [15].
В этом ПО командой Distance контекстного меню проводится измерение длин вирусных частиц и построение гистограммы распределения по длинам. Измеренные частицы удобно помечать маркерами, используя команду контекстного меню Marks. При анализе изображений можно найти наиболее вероятное значение длины вирусных частиц и оценить дисперсию получившегося распределения.
Работа учащегося практикума сканирующей зондовой микроскопии помогает ему освоить как теоретический материал, так и адекватно интерпретировать полученные результаты [16].
Литература
Soto C.M., Blum A.S., Vora G.J., et al. Fluorescent signal amplification of carbocyanine dyes using engineered viral nanoparticles. –
J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 5184–5189.
Blum A.S., Soto C.M., Wilson C.D., et al. An engineered virus as a scaffold for three-dimensional self-assembly on the nanoscale. – Small, 2005, 7, 702–706.
The Universal Virus Database.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/.
Drygin Y.F., Bordunova O.A., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy examination of TMV and virion RNA. – FEBS Lett., 1998, 425, 217–221.
Дубровин Е.В., Кирикова М.Н., Новиков В.К., Дрыгин Ю.Ф., Яминский И.В. Изучение особенностей адгезии вируса табачной мозаики методом атомно-силовой микроскопии. – Коллоидный журнал, 2004, 66, 750–755.
Образцова Е.А., Калинина Н.О., Тальянский М.Е., Габренайте-Верховская Р., Макинен К., Яминский И.В. Атомно-силовая микроскопия А-вируса картофеля. – Коллоидный журнал, 2008, 70, 199–201.
Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., Lucas R.W., McPherson A. Surface processes in the crystallization of turnip yellow mosaic virus visualized by atomic force microscopy. –
J. Struct. Biol., 1999, 127, 35–43.
Roos W.H., Ivanovska I.L., Evilevitch A., Wuite G.J.L. Viral capsids: Mechanical characteristics, genome packaging and delivery mechanisms. – Cell. Mol. Life Sci., 2007, 64, 1484–1497.
Matsko N., Klinov D., Manykin A., Demin V., Klimenko S. Atomic force microscopy analysis of bacteriophages φKZ and T4. – J. Electron Microsc., 2001, 50, 417–422.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., Tabekov J.G. AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. – J. Mol. Biol., 2003, 332, 321–325.
Falvo M.R., Washburn S., Superfine R., Finch M., Brooks F.P. Jr., Chi V., Taylor R.M. Manipulation of individual viruses: Friction and mechanical properties. – Biophys. J., 1997, 72, 1396–1403.
Britt D.W., Buijs J., Hlady V. Tobacco mosaic virus adsorption on self-assembled and Langmuir–Blodgett monolayers studied by TIRF and SFM. – Thin Solid Films, 1998, 327–329, 824–828.
Maeda H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. – Langmuir, 1997, 13, 4150–4161.
Руководство пользователя пакета программного обеспечения для управления сканирующим зондовым микроскопом и обработки изображений. http://www.rusnanonet.ru/download/equipment/fsonline_manual.pdf.
ФемтоСкан Онлайн,
http://www.nanoscopy.net/en/femtoscan-d.php.
Дубровин Е.В., Мешков Г.Б., Яминский И.В. Сканирующая зондовая микроскопия: получение трехмерных изображений. Начальное знакомство с методом исследования поверхности материалов и нанообъектов. Учебное пособие. Описание задачи лабораторного практикума. – М.: МГУ им. М.В.Ломоносова, 2009.
Отзывы читателей
