eng
Выпуск #4/2015
Г.Киселев, П.Горелкин, А.Ерофеев, Д.Колесов, И.Яминский
Детекция вирусов с помощью пьезоэлектрических кантилеверов
Детекция вирусов с помощью пьезоэлектрических кантилеверов
Просмотры: 5194
Быстрый прямой анализ вируса гриппа А в жидкой среде может выполняться с помощью пьезоэлектрического кантилевера с рецептором, модифицированным гликополимером, который содержит сиаловые группы, специфичные к белку оболочки вируса.
DOI:10.22184/1993-8578.2015.58.4.62.67
DOI:10.22184/1993-8578.2015.58.4.62.67
К современным сенсорным системам предъявляются экстремально высокие требования. К их критическим характеристикам можно отнести параметр предела чувствительности, линейные размеры датчика и скорость анализа. Во всем многообразии датчиков можно выделить активно развивающийся подкласс микроэлектромеханических систем (МЭМС) – различного рода резонаторов, наноамплитудные колебания в которых возбуждаются под действием переменного электромагнитного поля. Резонанс в таких системах напрямую зависит от их геометрической топологии. По своей сути МЭМС – это маятники, пружины, струны или мембраны, имеющие собственные частоты на различных гармониках.
Примером оригинального применения для получения научного результата хорошо известного из часовых механизмов резонатора кварцевой вилки может быть работа под руководством Франца Гизибла [1]. Наноколебания, возникающие в кварцевой вилке, которая служит для задания опорной частоты, очень пригодились сотрудникам университета Аугсбурга. Они предложили использовать вилку в качестве туннельного микроскопа, прикрепив на ее конец срез платиновой проволоки. Игла из проволоки служила щупом поверхности монокристаллического кремния (рис.1). Благодаря высокой добротности кварцевого резонатора атомную структуру кремния удалось разрешить с точностью до нескольких долей ангстрем.
МЭМС в контроле бактерий и вирусов
Все чаще делаются попытки использовать МЭМС в качестве датчиков на бактерии и вирусы. Последние достаточно хорошо характеризуются различными методами микроскопии, ПЦР, а также рамановскими спектрометрами, однако применять эти методы в повседневной жизни и интегрировать в бытовую технику практически невозможно. У МЭМС в этом отношении есть несравненные преимущества: их размер, а также простая система считывания электрического сигнала с датчика с применением широко используемых электронных компонентов.
Крайне актуальное направление для бытового применения микромеханических датчиков – контроль бактерий и вирусов, вызывающих распространенные заболевания, такие как грипп и пневмония.
На данный момент технологии позволяют создавать МЭМС, способные измерять отдельные вирусные частицы с чувствительностью 10–19 г/Гц [2] (рис.2а). В работе [3] было экспериментально продемонстрировано измерение массы вируса вакцины оспы величиной в 9,5 фг с использованием резонатора кантилеверного типа шириной 1,8 мкм и длиной 4 мкм (рис.2b).
За последнее десятилетие произошел критический прорыв в разработке микромеханических сенсорных систем c рекордными показателями чувствительности по массе [2] и количеству связавшегося анализируемого вещества [4]. Данные системы используют принципиально новый метод преобразования биохимических реакций в аналитический сигнал через статические деформации, возникающие в результате тепловых, электростатических и энтропийных эффектов внутри рецепторного слоя и структур МЭМС. При широком спектре операционных режимов (статический, динамический, контроль добротности и амплитуды аналитического сигнала) МЭМС являются полноценным дополнением электрохимических, оптических и акустических датчиков. Кроме того, комбинации различных схем регистрации аналитического сигнала позволяют оптимизировать работу МЭМС практически в любой среде [5]: вакууме, газовых и жидких фазах вещества. Микроскопические размеры сенсорных устройств дают возможность понизить предел их чувствительности до размеров отдельных бактерий [6] и вирусных частиц [2, 3].
В большом числе публикаций рассматривается использование для детекции вирусов резонансных датчиков различного типа. Самыми распространенными из них являются микровесы на основе кварцевого кристалла [7, 8, 9], а также датчик на основе эффекта поверхностных акустических волн в пьезокристалле [10]. В новых разработках также предлагается использовать емкостные микромеханические ультразвуковые преобразователи [11] и мембранные пьезоакустические резонаторы [12]. Все эти методы эффективны и, как правило, сводятся к контролю резонансной частоты МЭМС. В самых простых случаях для МЭМС справедлива формула гармонического осциллятора, из которой следует, что уменьшение собственной частоты системы пропорционально корню из присоединенной массы. Однако в некоторых случаях чувствительность МЭМС зависит не только от эффекта присоединенной массы, но и от напряжений, возникающих в рецепторе датчика в результате присоединения аналита. Напряжения ведут к увеличению жесткости системы и являются альтернативой присоединению массы для регистрации изменения резонансной частоты [13].
Анализ вирусных частиц с применением пьезокерамического кантилевера
Совместной лабораторией LG Electronics и МГУ им. М.В.Ломоносова была проведена экспериментальная работа по анализу вирусных частиц в жидкой среде посредством пьезокерамического кантилевера (рис.3).
Кантилевер размерами 2 × 3 мм был вырезан с помощью алмазного диска из композитной мембраны, состоящей из 60-микронного слоя латуни и 50-микронного слоя PZT-керамики, покрытого серебряной пленкой. Кантилевер на две минуты был помещен в раствор серной кислоты в 37% растворе перекиси водорода 1 : 1, промыт в 98% этаноле и в течение 16 час, инкубировался в растворе 4-аминотиофенола 10-3 M в этаноле. После инкубации и последовательной промывки в этаноле и в воде он был помещен в водный раствор сиалового гликополимера на 12 час. Затем на поверхности рецептора была сформирована пленка, содержащая гликополимерные группы, специфичные гемагглютинину – белку оболочки вируса гриппа А A/Duck/Moscow/4182/2008 (Институт полиомиелита и вирусного энцефалита РАМН, Москва), который использовался в данной работе.
Вирус гриппа А был получен путем 10-дневного инфицирования эмбриона цыпленка в курином яйце с последующим извлечением из яйца аллантоисной жидкости. Изначальная концентрация вируса в аллантоисной жидкости составляла около 1·108 вирионов/мл. Тестовый раствор с концентрацией 1·106 вирионов/мл был подготовлен путем разведения изначального раствора в 100 раз в неинфицированной аллантоисной жидкости.
Измерения проводились на продольной моде колебаний кантилевера в аллантоисной жидкости. Продольная мода, в отличие от моды изгиба, имеет большую добротность в жидкости вследствие минимального трения кантилевера в среде. Частота продольной моды (рис.4) определялась с помощью электронного блока атомно-силового микроскопа "Фемтоскан" (НПП "Центр перспективных технологий", Москва, www.nanoscopy.ru).
Перед измерением кантилевер инкубировался в не содержащей вируса аллантоисной жидкости в условиях потока. После того как средний дрейф (Δf/f) устанавливался на уровне 0,5·10-3, в систему добавлялся раствор вирусных частиц с концентрацией 1·106 вирионов/мл.
Известно, что взаимодействие между вирусом и рецепторным слоем на поверхности датчика обуславливает дополнительные напряжения в пленке [14] или повышение эффективной жесткости системы в целом [13]. Это как раз и приводит к увеличению резонансной частоты. На данный момент мы получили положительное изменение резонансной частоты кантилевера при сорбции на его поверхность вирусных частиц из концентрации 106 вирион/мл (рис.5). Соотношение сигнал/шум при этом составило 5 : 1, что говорит о перспективности использования пьезокерамических кантилеверов в подобных приложениях.
Таким образом, можно заключить, что будущее развитие нанотехнологических биосенсоров, способных измерять массу отдельных вирусных частиц, а также слабые изменения напряжений в молекулярных пленках, может быть основано на микроэлектромеханических системах, которые уже демонстрируют хорошую чувствительность, компактность и простоту прямого анализа.
Работа проведена в совместной лаборатории LG Electronics и МГУ имени М.В.Ломоносова в рамках договоров № JM-02/2014 и № JY-01/2014. Авторы выражают благодарность сотрудникам института Полиомиелита и вирусного энцефалита РАМН A.Гамбарян и A.Тузикову, а также Н.Бовину (ИБХ РАН) за подготовку вируса и синтез гликополимера. Отдельно авторы благодарят K.Квака и И.Бородину (LG Electronics).
ЛИТЕРАТУРА
1. Giessibl F.J., Hembacher S., Bielefeldt H., Mannhart J. Science 289, 422 (2000).
2. Ilic B., Yang Y., Craighead H.G. Virus detection using nanoelectromechanical devices // Appl. Phys. Lett. 2004. Vol. 85. No.13. Р. 2604–2606.
3. Gupta, Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness // Appl. Phys. Lett. 2004. Vol. 84. No. 11. Р.1976–1978.
4. Yaminsky I., Gorelkin P., Kiselev G. Concurrence of Intermolecular Foces in Monolayers // Japanese Journal of Applied Physics. 2006. Vol. 45. No. 3B. Р. 2316–2318.
5. Lavrik N.V., Sepaniak M.J., Datskos P.G. Cantilever transducers as a platform for chemical and biological sensors // Rev. of Sci. Ins. 2004. Vol. 75. No. 7. Р. 2229–2253.
6. Iliс. Using a nanomechanical cantilever and atomic force microscopy to measure bacterial cell mass // Microscopy and Analysis. 2003. Р. 9.
7. Peduru T.M. Hewa et al. The detection of influenza A and B viruses in clinical specimens using a quartz crystal microbalance // Journal of Virological Methods 162 (2009) 14–21.
8. Li et al. A nanobeads amplified QCM immunosensor for the detection of avian influenza virus H5N1 // Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 4146–4154.
9. Brockman L. et al. QCM Aptasensor for Rapid and Specific Detection of Avian Influenza Virus // Open Journal of Applied Biosensor. 2013. 2. 97–103.
10. Wang Y. et al. Rapid detection of human papilloma virus using a novel leaky surface acoustic wave peptide nucleic acid biosensor // Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 3455–3460.
11. Ramanaviciene Almira et al. Capacitive micromachined ultrasound transducer (cMUT) for immunosensor design // Analyst. 2010. 135. 1531–1534.
12. Nirschl Martin at al, CMOS-Integrated Film Bulk Acoustic Resonators for Label-Free Biosensing // Sensors 2010. 10. 4180–4193; doi:10.3390/s100504180.
13. Shih W.Y., Zhu Q., Shih W.-H., Length and thickness dependence of longitudinal flexural resonance frequency shifts of a piezoelectric microcantilever sensor due to Young’s modulus change J. Appl. Phys. 2008 104, 074503.
14. Godin M.; Tabard-Cossa V.; Miyahara Y.; Monga T.; Williams P.J.; Beaulieu L.Y.; Bruce Lennox R.; Grutter P. Cantilever-based sensing: the origin of surface stress and optimization strategies. //Nanotechnology. 2010. 21(7). 75501.
Примером оригинального применения для получения научного результата хорошо известного из часовых механизмов резонатора кварцевой вилки может быть работа под руководством Франца Гизибла [1]. Наноколебания, возникающие в кварцевой вилке, которая служит для задания опорной частоты, очень пригодились сотрудникам университета Аугсбурга. Они предложили использовать вилку в качестве туннельного микроскопа, прикрепив на ее конец срез платиновой проволоки. Игла из проволоки служила щупом поверхности монокристаллического кремния (рис.1). Благодаря высокой добротности кварцевого резонатора атомную структуру кремния удалось разрешить с точностью до нескольких долей ангстрем.
МЭМС в контроле бактерий и вирусов
Все чаще делаются попытки использовать МЭМС в качестве датчиков на бактерии и вирусы. Последние достаточно хорошо характеризуются различными методами микроскопии, ПЦР, а также рамановскими спектрометрами, однако применять эти методы в повседневной жизни и интегрировать в бытовую технику практически невозможно. У МЭМС в этом отношении есть несравненные преимущества: их размер, а также простая система считывания электрического сигнала с датчика с применением широко используемых электронных компонентов.
Крайне актуальное направление для бытового применения микромеханических датчиков – контроль бактерий и вирусов, вызывающих распространенные заболевания, такие как грипп и пневмония.
На данный момент технологии позволяют создавать МЭМС, способные измерять отдельные вирусные частицы с чувствительностью 10–19 г/Гц [2] (рис.2а). В работе [3] было экспериментально продемонстрировано измерение массы вируса вакцины оспы величиной в 9,5 фг с использованием резонатора кантилеверного типа шириной 1,8 мкм и длиной 4 мкм (рис.2b).
За последнее десятилетие произошел критический прорыв в разработке микромеханических сенсорных систем c рекордными показателями чувствительности по массе [2] и количеству связавшегося анализируемого вещества [4]. Данные системы используют принципиально новый метод преобразования биохимических реакций в аналитический сигнал через статические деформации, возникающие в результате тепловых, электростатических и энтропийных эффектов внутри рецепторного слоя и структур МЭМС. При широком спектре операционных режимов (статический, динамический, контроль добротности и амплитуды аналитического сигнала) МЭМС являются полноценным дополнением электрохимических, оптических и акустических датчиков. Кроме того, комбинации различных схем регистрации аналитического сигнала позволяют оптимизировать работу МЭМС практически в любой среде [5]: вакууме, газовых и жидких фазах вещества. Микроскопические размеры сенсорных устройств дают возможность понизить предел их чувствительности до размеров отдельных бактерий [6] и вирусных частиц [2, 3].
В большом числе публикаций рассматривается использование для детекции вирусов резонансных датчиков различного типа. Самыми распространенными из них являются микровесы на основе кварцевого кристалла [7, 8, 9], а также датчик на основе эффекта поверхностных акустических волн в пьезокристалле [10]. В новых разработках также предлагается использовать емкостные микромеханические ультразвуковые преобразователи [11] и мембранные пьезоакустические резонаторы [12]. Все эти методы эффективны и, как правило, сводятся к контролю резонансной частоты МЭМС. В самых простых случаях для МЭМС справедлива формула гармонического осциллятора, из которой следует, что уменьшение собственной частоты системы пропорционально корню из присоединенной массы. Однако в некоторых случаях чувствительность МЭМС зависит не только от эффекта присоединенной массы, но и от напряжений, возникающих в рецепторе датчика в результате присоединения аналита. Напряжения ведут к увеличению жесткости системы и являются альтернативой присоединению массы для регистрации изменения резонансной частоты [13].
Анализ вирусных частиц с применением пьезокерамического кантилевера
Совместной лабораторией LG Electronics и МГУ им. М.В.Ломоносова была проведена экспериментальная работа по анализу вирусных частиц в жидкой среде посредством пьезокерамического кантилевера (рис.3).
Кантилевер размерами 2 × 3 мм был вырезан с помощью алмазного диска из композитной мембраны, состоящей из 60-микронного слоя латуни и 50-микронного слоя PZT-керамики, покрытого серебряной пленкой. Кантилевер на две минуты был помещен в раствор серной кислоты в 37% растворе перекиси водорода 1 : 1, промыт в 98% этаноле и в течение 16 час, инкубировался в растворе 4-аминотиофенола 10-3 M в этаноле. После инкубации и последовательной промывки в этаноле и в воде он был помещен в водный раствор сиалового гликополимера на 12 час. Затем на поверхности рецептора была сформирована пленка, содержащая гликополимерные группы, специфичные гемагглютинину – белку оболочки вируса гриппа А A/Duck/Moscow/4182/2008 (Институт полиомиелита и вирусного энцефалита РАМН, Москва), который использовался в данной работе.
Вирус гриппа А был получен путем 10-дневного инфицирования эмбриона цыпленка в курином яйце с последующим извлечением из яйца аллантоисной жидкости. Изначальная концентрация вируса в аллантоисной жидкости составляла около 1·108 вирионов/мл. Тестовый раствор с концентрацией 1·106 вирионов/мл был подготовлен путем разведения изначального раствора в 100 раз в неинфицированной аллантоисной жидкости.
Измерения проводились на продольной моде колебаний кантилевера в аллантоисной жидкости. Продольная мода, в отличие от моды изгиба, имеет большую добротность в жидкости вследствие минимального трения кантилевера в среде. Частота продольной моды (рис.4) определялась с помощью электронного блока атомно-силового микроскопа "Фемтоскан" (НПП "Центр перспективных технологий", Москва, www.nanoscopy.ru).
Перед измерением кантилевер инкубировался в не содержащей вируса аллантоисной жидкости в условиях потока. После того как средний дрейф (Δf/f) устанавливался на уровне 0,5·10-3, в систему добавлялся раствор вирусных частиц с концентрацией 1·106 вирионов/мл.
Известно, что взаимодействие между вирусом и рецепторным слоем на поверхности датчика обуславливает дополнительные напряжения в пленке [14] или повышение эффективной жесткости системы в целом [13]. Это как раз и приводит к увеличению резонансной частоты. На данный момент мы получили положительное изменение резонансной частоты кантилевера при сорбции на его поверхность вирусных частиц из концентрации 106 вирион/мл (рис.5). Соотношение сигнал/шум при этом составило 5 : 1, что говорит о перспективности использования пьезокерамических кантилеверов в подобных приложениях.
Таким образом, можно заключить, что будущее развитие нанотехнологических биосенсоров, способных измерять массу отдельных вирусных частиц, а также слабые изменения напряжений в молекулярных пленках, может быть основано на микроэлектромеханических системах, которые уже демонстрируют хорошую чувствительность, компактность и простоту прямого анализа.
Работа проведена в совместной лаборатории LG Electronics и МГУ имени М.В.Ломоносова в рамках договоров № JM-02/2014 и № JY-01/2014. Авторы выражают благодарность сотрудникам института Полиомиелита и вирусного энцефалита РАМН A.Гамбарян и A.Тузикову, а также Н.Бовину (ИБХ РАН) за подготовку вируса и синтез гликополимера. Отдельно авторы благодарят K.Квака и И.Бородину (LG Electronics).
ЛИТЕРАТУРА
1. Giessibl F.J., Hembacher S., Bielefeldt H., Mannhart J. Science 289, 422 (2000).
2. Ilic B., Yang Y., Craighead H.G. Virus detection using nanoelectromechanical devices // Appl. Phys. Lett. 2004. Vol. 85. No.13. Р. 2604–2606.
3. Gupta, Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness // Appl. Phys. Lett. 2004. Vol. 84. No. 11. Р.1976–1978.
4. Yaminsky I., Gorelkin P., Kiselev G. Concurrence of Intermolecular Foces in Monolayers // Japanese Journal of Applied Physics. 2006. Vol. 45. No. 3B. Р. 2316–2318.
5. Lavrik N.V., Sepaniak M.J., Datskos P.G. Cantilever transducers as a platform for chemical and biological sensors // Rev. of Sci. Ins. 2004. Vol. 75. No. 7. Р. 2229–2253.
6. Iliс. Using a nanomechanical cantilever and atomic force microscopy to measure bacterial cell mass // Microscopy and Analysis. 2003. Р. 9.
7. Peduru T.M. Hewa et al. The detection of influenza A and B viruses in clinical specimens using a quartz crystal microbalance // Journal of Virological Methods 162 (2009) 14–21.
8. Li et al. A nanobeads amplified QCM immunosensor for the detection of avian influenza virus H5N1 // Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 4146–4154.
9. Brockman L. et al. QCM Aptasensor for Rapid and Specific Detection of Avian Influenza Virus // Open Journal of Applied Biosensor. 2013. 2. 97–103.
10. Wang Y. et al. Rapid detection of human papilloma virus using a novel leaky surface acoustic wave peptide nucleic acid biosensor // Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 3455–3460.
11. Ramanaviciene Almira et al. Capacitive micromachined ultrasound transducer (cMUT) for immunosensor design // Analyst. 2010. 135. 1531–1534.
12. Nirschl Martin at al, CMOS-Integrated Film Bulk Acoustic Resonators for Label-Free Biosensing // Sensors 2010. 10. 4180–4193; doi:10.3390/s100504180.
13. Shih W.Y., Zhu Q., Shih W.-H., Length and thickness dependence of longitudinal flexural resonance frequency shifts of a piezoelectric microcantilever sensor due to Young’s modulus change J. Appl. Phys. 2008 104, 074503.
14. Godin M.; Tabard-Cossa V.; Miyahara Y.; Monga T.; Williams P.J.; Beaulieu L.Y.; Bruce Lennox R.; Grutter P. Cantilever-based sensing: the origin of surface stress and optimization strategies. //Nanotechnology. 2010. 21(7). 75501.
Отзывы читателей
