eng
Выпуск #8/2015
М.Рубцова, М.Уляшова, Г.Преснова, А.Егоров, Е.Ларионова, Л.Черноусова, И.Яминский, Д.Яминский, А.Ахметова.
Молекулярно-генетическая экспресс-идентификация туберкулеза и его устойчивости к антибиотикам
Молекулярно-генетическая экспресс-идентификация туберкулеза и его устойчивости к антибиотикам
Просмотры: 6867
С целью разработки комплекса диагностических тест-систем для быстрого выявления микобактерий туберкулеза и определения их устойчивых к антибиотикам форм создан международный консорциум, в котором Россию представляют компания "Центр перспективных технологий", МГУ им. М.В.Ломоносова и ЦНИИ туберкулеза. Планируется разработать несколько тест-систем для комплексной диагностики с применением молекулярно-генетических и иммунологических методов мультианализа микобактерий на биочипах.
DOI:10.22184/1993-8578.2015.62.8.46.54
DOI:10.22184/1993-8578.2015.62.8.46.54
Теги: biochip medical diagnosis mycobacterium scanning probe microscopy tuberculosis биочип медицинская диагностика микобактерия сканирующая зондовая микроскопия туберкулез
Последние десятилетия во многих странах мира, независимо от их экономического статуса и уровня жизни населения, отмечается неуклонный рост заболеваемости туберкулезом (ТБ). Поэтому разработка новых методов диагностики и лечения ТБ продолжает оставаться актуальной. По данным ВОЗ [1, 2] совершенствование этих методов позволило добиться снижения смертности на 45% за период с 1990 по 2013 годы, что в абсолютных значениях составляет десятки миллионов спасенных человеческих жизней. Однако показатели по-прежнему угрожающие: по оценкам ВОЗ в 2013 году 9 млн. человек заболели туберкулезом, причем около 64% случаев заболевания были выявлены впервые. Смертность в 2013 году составила 1,5 млн. человек. Особую опасность представляют сочетание ТБ- и ВИЧ-инфекций, которые сложнее диагностировать и лечить. Около 1,1 млн. (13%) всех ТБ-больных инфицированы ВИЧ.
Существенной проблемой является устойчивость микобактерий ТБ (M.tuberculosis) к действию антибиотиков – основного средства лечения этого заболевания [3, 4]. В настоящее время выделяют следующие виды устойчивости:
•множественную лекарственную устойчивость (МЛУ, англ. – multiple drug resistance, MDR) – устойчивость возбудителя ТБ к основным антибиотикам первого ряда (изониазид, рифампицин);
•широкую лекарственную устойчивость (ШЛУ, англ. – extensively drug resistance, XDR) – сочетанную устойчивость к антибиотикам первого и второго ряда (изониазид, рифампицин, фторхинолоны, аминогликозиды и др.).
Устойчивость связана с мутациями в определенных генах микобактерий, причем каждый конкретный тип устойчивости обусловлен наличием нескольких мутаций.
Исследование в разных регионах мира обнаружило более половины устойчивых возбудителей ТБ в трех странах: Индии, Китае и России. Неадекватное лечение может вызвать селективный отбор резистентных штаммов. С клинической точки зрения причинами возникновения резистентных штаммов являются поздняя диагностика первичной лекарственной устойчивости возбудителя, неадекватное или незавершенное предыдущее лечение. ШЛУ ТБ – наиболее сложный для лечения вид резистентности. Факторами риска развития ШЛУ являются первичная МЛУ, распространенный двухсторонний процесс в легких, более трех курсов химиотерапии туберкулеза в анамнезе и применение противотуберкулезных препаратов резервного ряда в предыдущих курсах химиотерапии.
Россия относится к странам с высокой заболеваемостью ТБ. Существенной и наиболее важной проблемой в развитии туберкулезной эпидемии являются распространяющиеся среди населения штаммы, устойчивые к большинству препаратов, применяемых в противотуберкулезной терапии. Особую опасность представляет рост доли ШЛУ ТБ с 4,9 до 20% [1]. Эти пациенты представляют собой опасный "резервуар" устойчивых инфекций, на которые не действуют известные антибиотики. Возникает серьезная угроза неконтролируемого распространения штаммов микобактерий, обладающих ШЛУ. Заболевание передается воздушно-капельным путем, что создает угрозу его распространения в крупных городах с высокой плотностью населения и большими потоками мигрантов, значительная часть которых не обследована. Поэтому так важно воспрепятствовать увеличению случаев заболевания тяжелыми формами ТБ, которые характеризуются высокой смертностью.
Молекулярно-генетический анализ
Поскольку лекарственная резистентность обусловлена мутациями в генах микобактерий ТБ, перспективным является применение методов молекулярно-генетического анализа. В последние годы активно развиваются технологии секвенирования и мультиплексного молекулярно-генетического анализа: мультиплексная ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с дальнейшей гибридизацией на биочипах различного типа [5–7]. Секвенирование в основном используется в научных исследованиях, так как для практического применения в клинических лабораториях эта технология сложна, характеризуется высокой стоимостью оборудования и имеет ограничения, связанные с вероятностью ложных результатов.
Разнообразие форм устойчивости и наличие штаммов, резистентных одновременно к нескольким препаратам, требуют развития технологий мультианализа микобактерий туберкулеза на биочипах для ускоренного обнаружения возбудителя и определения его устойчивости к антибиотикам как первого, так и второго ряда в одном анализе. Мультиплексный анализ на биочипах позволяет выявить десятки, сотни и даже тысячи видоспецифичных генетических последовательностей, а также генетических вариаций, определяющих резистентность микобактерий к антибактериальной терапии.
Проект "Мульти-ТБ"
Компания "Центр перспективных технологий", МГУ им. М.В. Ломоносова и ЦНИИ туберкулеза участвуют в международном проекте "Мульти-ТБ" по созданию биочипа, позволяющего идентифицировать множество генов и наличие мутаций в них в одном анализе. Иностранные партнеры проекта представлены немецкой научной группой биоаналитики и биопроцессов Института клеточной терапии и иммунологии общества Фраунхофера (Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Branch Bioanalytics and Bioprocesses) и немецкой компанией LIONEX Diagnostics & Therapeutics. Задачей международного консорциума является разработка комплекса диагностических тест-систем для быстрого выявления микобактерий ТБ и определения их устойчивых к антибиотикам форм на основе молекулярно-генетической и иммунологической диагностики. В рамках проекта предполагается создать несколько типов диагностических систем.
Все разработанные к настоящему времени и зарегистрированные для практического применения методы имеют ограничения, связанные с недостаточной мультиплексностью или сложностью и высокой стоимостью анализа. Ни один из методов не позволяет одновременно выявлять микобактерии ТБ и определять их устойчивость к препаратам как первого, так и второго ряда. Как правило, технологии, обеспечивающие высокую мультиплексность, являются трудоемкими, длительными по времени и требуют дорогостоящих компонентов и оборудования, что ограничивает их применение в реальной практике.
В проекте "Мульти-ТБ" планируется разработать несколько диагностических тест-систем, которые позволят проводить комплексную диагностику в три этапа. Первый этап предполагает быстрый анализ мокроты, который позволит обнаружить микобактерии в течение нескольких минут с использованием специфических антител, меченных наночастицами золота. Для подтверждения положительных результатов будет разработана тест-система на основе биочип-картриджа, сочетающего мультианализ на биочипе и флюидные технологии. В качестве специфических реагентов для определения специфического паттерна антител пациента будут использованы белковые маркеры-антигены. На этот же биочип будут добавляться антигены ВИЧ для одновременного обнаружения ко-инфекции ТБ и ВИЧ. Для третьего этапа диагностики будут разработаны молекулярно-генетические методы обнаружения генетических маркеров лекарственной устойчивости микобактерий на основе мультианализа на биочипах.
В связи с необходимостью проведения масштабных скрининговых исследований распространения возбудителей ТБ и его антибиотикоустойчивых форм при выработке стратегии основное внимание будет уделяться производительности технологий, времени проведения анализа и возможности внедрения в диагностические лаборатории различного уровня.
Российскими партнерами будет разработана диагностическая тест-система молекулярно-генетического мультианализа для ускоренного обнаружения микобактерий ТБ и определения их устойчивости к препаратам как первого, так и второго ряда в одном анализе. Технологическое решение будет основано на колориметрической детекции, преимущества которой были показаны при идентификации устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам [8]. Качественное изменение по сравнению с существующими в настоящее время молекулярно-генетическими методами будет заключаться в принципиальном расширении набора генетических маркеров для идентификации типа устойчивости одновременно к антибиотикам первого и второго ряда. Качественное изменение технологии биочипов будет состоять в выборе способов их изготовления, проведения гибридизационного анализа и детекции. Для упрощения методики, сокращения времени анализа и его адаптации к возможностям клинических лабораторий биочипы будут нанесены методом контактной печати в лунки 96-луночных планшетов (рис.1), разделенных на 8-луночные стрипы. Это позволит упростить стадии гибридизации, детекции и отмывки, которые могут быть выполнены с использованием стандартного оборудования для иммуноферментного анализа, доступного для лабораторий различного уровня. Будет проведена оптимизация условий гибридизационного анализа с целью сокращения времени при сохранении необходимых чувствительности и специфичности. Возможность автоматизации различных стадий анализа способствует сокращению общего времени анализа.
Колориметрическая система детекции будет основана на использовании биотина в качестве метки ДНК и выявлении его конъюгатом стрептавидина с ферментом пероксидазой. О положительном результате комплементарной гибридизации будет свидетельствовать окрашивание зоны биочипа (рис.2), регистрируемое оптическим методом. Это позволит разработать более дешевую систему детекции по сравнению с часто используемой в настоящее время флуоресцентной.
Для оптимизации технологии молекулярно-генетической идентификации туберкулеза эффективным инструментом является сканирующая зондовая микроскопия, которая позволяет прямым образом наблюдать состояние поверхности биочипа как при его производстве, так и в процессе его использования для диагностики (рис.3, 4). В работах [9, 10] представлен краткий обзор применения атомно-силовой микроскопии (АСМ) для изучения поверхности микрочипов с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами и анализа результатов гибридизации ДНК-мишени; развиты подходы для основанного на АСМ количественного анализа ДНК на микрочипах с использованием таких параметров как высота, площадь и объем объектов на АСМ-изображениях; рассмотрены результаты АСМ-исследований поверхности ДНК-микрочипов до и после гибридизации, а также по детектированию ДНК с использованием золотых наночастиц в качестве метки.
ЛИТЕРАТУРА
1.WHO (2014) Global tuberculosis report 2014.
2.WHO. (2013). Global tuberculosis report 2013.
3.Gandhi Neel R., Nunn Paul, Dheda Keertan, Schaaf H. Simon, Zignol Matteo, Soolingen Dick van, Jensen Paul, Bayona Jaime // The Lancet. 2010.Vol. 375. РР. 1830–1843.
4.Fonseca J.D., Knight G.M., McHugh T.D. The complex evolution of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Infect Dis., 2015, 32: 94–100.
5.Scott L.E., McCarthy K, Gous N., Nduna M., Van Rie A., Sanne I., Venter W.F., Duse A., Stevens W. Comparison of Xpert MTB/RIF with other nucleic acid technologies for diagnosing pulmonary tuberculosis in a high HIV prevalence setting: a prospective study. PloS Med, 2011, 8: e1001061.
6.Ilina E.N., Shitikov E.A., Ikryannikova L.N., Alekseev D.G., Kamashev D.E., Malakhova M.V. et al. Comparative Genomic Analysis of Mycobacterium tuberculosis Drug Resistant Strains from Russia. PLoS One, 2013, 8(2): e56577.
7.Zimenkov D.V., Antonova O.V., Kuz’min A.V., Isaeva Y.D., Krylova L.Y. et al. Detection of second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays. BMC Infectious Diseases 2013, 13: 240.
8.Rubtsova M.Yu., Ulyashova M.M., Edelstein M.V., Egorov A.M. Oligonucleotide microarrays with horseradish peroxidase-based detection for the identification of extended-spectrum β-lactamases. Biosens. & Bioelectron, 2010, 26, 1252–1260.
9.Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Егоров А.М., Григоренко В.Г., Яминский И.В. Применение атомно-силовой микроскопии для 3D-анализа результатов гибридизации нуклеиновых кислот на микрочипах. Acta Naturae 2015, 7, 117–124.
10.Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Григоренко В.Г., Иванин А.И., Егоров А.М., Яминский И.В. Применение сканирующей зондовой микроскопии в решении задач молекулярной диагностики. Биомедицинская химия 2014, 60, 543–547.
Существенной проблемой является устойчивость микобактерий ТБ (M.tuberculosis) к действию антибиотиков – основного средства лечения этого заболевания [3, 4]. В настоящее время выделяют следующие виды устойчивости:
•множественную лекарственную устойчивость (МЛУ, англ. – multiple drug resistance, MDR) – устойчивость возбудителя ТБ к основным антибиотикам первого ряда (изониазид, рифампицин);
•широкую лекарственную устойчивость (ШЛУ, англ. – extensively drug resistance, XDR) – сочетанную устойчивость к антибиотикам первого и второго ряда (изониазид, рифампицин, фторхинолоны, аминогликозиды и др.).
Устойчивость связана с мутациями в определенных генах микобактерий, причем каждый конкретный тип устойчивости обусловлен наличием нескольких мутаций.
Исследование в разных регионах мира обнаружило более половины устойчивых возбудителей ТБ в трех странах: Индии, Китае и России. Неадекватное лечение может вызвать селективный отбор резистентных штаммов. С клинической точки зрения причинами возникновения резистентных штаммов являются поздняя диагностика первичной лекарственной устойчивости возбудителя, неадекватное или незавершенное предыдущее лечение. ШЛУ ТБ – наиболее сложный для лечения вид резистентности. Факторами риска развития ШЛУ являются первичная МЛУ, распространенный двухсторонний процесс в легких, более трех курсов химиотерапии туберкулеза в анамнезе и применение противотуберкулезных препаратов резервного ряда в предыдущих курсах химиотерапии.
Россия относится к странам с высокой заболеваемостью ТБ. Существенной и наиболее важной проблемой в развитии туберкулезной эпидемии являются распространяющиеся среди населения штаммы, устойчивые к большинству препаратов, применяемых в противотуберкулезной терапии. Особую опасность представляет рост доли ШЛУ ТБ с 4,9 до 20% [1]. Эти пациенты представляют собой опасный "резервуар" устойчивых инфекций, на которые не действуют известные антибиотики. Возникает серьезная угроза неконтролируемого распространения штаммов микобактерий, обладающих ШЛУ. Заболевание передается воздушно-капельным путем, что создает угрозу его распространения в крупных городах с высокой плотностью населения и большими потоками мигрантов, значительная часть которых не обследована. Поэтому так важно воспрепятствовать увеличению случаев заболевания тяжелыми формами ТБ, которые характеризуются высокой смертностью.
Молекулярно-генетический анализ
Поскольку лекарственная резистентность обусловлена мутациями в генах микобактерий ТБ, перспективным является применение методов молекулярно-генетического анализа. В последние годы активно развиваются технологии секвенирования и мультиплексного молекулярно-генетического анализа: мультиплексная ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с дальнейшей гибридизацией на биочипах различного типа [5–7]. Секвенирование в основном используется в научных исследованиях, так как для практического применения в клинических лабораториях эта технология сложна, характеризуется высокой стоимостью оборудования и имеет ограничения, связанные с вероятностью ложных результатов.
Разнообразие форм устойчивости и наличие штаммов, резистентных одновременно к нескольким препаратам, требуют развития технологий мультианализа микобактерий туберкулеза на биочипах для ускоренного обнаружения возбудителя и определения его устойчивости к антибиотикам как первого, так и второго ряда в одном анализе. Мультиплексный анализ на биочипах позволяет выявить десятки, сотни и даже тысячи видоспецифичных генетических последовательностей, а также генетических вариаций, определяющих резистентность микобактерий к антибактериальной терапии.
Проект "Мульти-ТБ"
Компания "Центр перспективных технологий", МГУ им. М.В. Ломоносова и ЦНИИ туберкулеза участвуют в международном проекте "Мульти-ТБ" по созданию биочипа, позволяющего идентифицировать множество генов и наличие мутаций в них в одном анализе. Иностранные партнеры проекта представлены немецкой научной группой биоаналитики и биопроцессов Института клеточной терапии и иммунологии общества Фраунхофера (Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Branch Bioanalytics and Bioprocesses) и немецкой компанией LIONEX Diagnostics & Therapeutics. Задачей международного консорциума является разработка комплекса диагностических тест-систем для быстрого выявления микобактерий ТБ и определения их устойчивых к антибиотикам форм на основе молекулярно-генетической и иммунологической диагностики. В рамках проекта предполагается создать несколько типов диагностических систем.
Все разработанные к настоящему времени и зарегистрированные для практического применения методы имеют ограничения, связанные с недостаточной мультиплексностью или сложностью и высокой стоимостью анализа. Ни один из методов не позволяет одновременно выявлять микобактерии ТБ и определять их устойчивость к препаратам как первого, так и второго ряда. Как правило, технологии, обеспечивающие высокую мультиплексность, являются трудоемкими, длительными по времени и требуют дорогостоящих компонентов и оборудования, что ограничивает их применение в реальной практике.
В проекте "Мульти-ТБ" планируется разработать несколько диагностических тест-систем, которые позволят проводить комплексную диагностику в три этапа. Первый этап предполагает быстрый анализ мокроты, который позволит обнаружить микобактерии в течение нескольких минут с использованием специфических антител, меченных наночастицами золота. Для подтверждения положительных результатов будет разработана тест-система на основе биочип-картриджа, сочетающего мультианализ на биочипе и флюидные технологии. В качестве специфических реагентов для определения специфического паттерна антител пациента будут использованы белковые маркеры-антигены. На этот же биочип будут добавляться антигены ВИЧ для одновременного обнаружения ко-инфекции ТБ и ВИЧ. Для третьего этапа диагностики будут разработаны молекулярно-генетические методы обнаружения генетических маркеров лекарственной устойчивости микобактерий на основе мультианализа на биочипах.
В связи с необходимостью проведения масштабных скрининговых исследований распространения возбудителей ТБ и его антибиотикоустойчивых форм при выработке стратегии основное внимание будет уделяться производительности технологий, времени проведения анализа и возможности внедрения в диагностические лаборатории различного уровня.
Российскими партнерами будет разработана диагностическая тест-система молекулярно-генетического мультианализа для ускоренного обнаружения микобактерий ТБ и определения их устойчивости к препаратам как первого, так и второго ряда в одном анализе. Технологическое решение будет основано на колориметрической детекции, преимущества которой были показаны при идентификации устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам [8]. Качественное изменение по сравнению с существующими в настоящее время молекулярно-генетическими методами будет заключаться в принципиальном расширении набора генетических маркеров для идентификации типа устойчивости одновременно к антибиотикам первого и второго ряда. Качественное изменение технологии биочипов будет состоять в выборе способов их изготовления, проведения гибридизационного анализа и детекции. Для упрощения методики, сокращения времени анализа и его адаптации к возможностям клинических лабораторий биочипы будут нанесены методом контактной печати в лунки 96-луночных планшетов (рис.1), разделенных на 8-луночные стрипы. Это позволит упростить стадии гибридизации, детекции и отмывки, которые могут быть выполнены с использованием стандартного оборудования для иммуноферментного анализа, доступного для лабораторий различного уровня. Будет проведена оптимизация условий гибридизационного анализа с целью сокращения времени при сохранении необходимых чувствительности и специфичности. Возможность автоматизации различных стадий анализа способствует сокращению общего времени анализа.
Колориметрическая система детекции будет основана на использовании биотина в качестве метки ДНК и выявлении его конъюгатом стрептавидина с ферментом пероксидазой. О положительном результате комплементарной гибридизации будет свидетельствовать окрашивание зоны биочипа (рис.2), регистрируемое оптическим методом. Это позволит разработать более дешевую систему детекции по сравнению с часто используемой в настоящее время флуоресцентной.
Для оптимизации технологии молекулярно-генетической идентификации туберкулеза эффективным инструментом является сканирующая зондовая микроскопия, которая позволяет прямым образом наблюдать состояние поверхности биочипа как при его производстве, так и в процессе его использования для диагностики (рис.3, 4). В работах [9, 10] представлен краткий обзор применения атомно-силовой микроскопии (АСМ) для изучения поверхности микрочипов с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами и анализа результатов гибридизации ДНК-мишени; развиты подходы для основанного на АСМ количественного анализа ДНК на микрочипах с использованием таких параметров как высота, площадь и объем объектов на АСМ-изображениях; рассмотрены результаты АСМ-исследований поверхности ДНК-микрочипов до и после гибридизации, а также по детектированию ДНК с использованием золотых наночастиц в качестве метки.
ЛИТЕРАТУРА
1.WHO (2014) Global tuberculosis report 2014.
2.WHO. (2013). Global tuberculosis report 2013.
3.Gandhi Neel R., Nunn Paul, Dheda Keertan, Schaaf H. Simon, Zignol Matteo, Soolingen Dick van, Jensen Paul, Bayona Jaime // The Lancet. 2010.Vol. 375. РР. 1830–1843.
4.Fonseca J.D., Knight G.M., McHugh T.D. The complex evolution of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Infect Dis., 2015, 32: 94–100.
5.Scott L.E., McCarthy K, Gous N., Nduna M., Van Rie A., Sanne I., Venter W.F., Duse A., Stevens W. Comparison of Xpert MTB/RIF with other nucleic acid technologies for diagnosing pulmonary tuberculosis in a high HIV prevalence setting: a prospective study. PloS Med, 2011, 8: e1001061.
6.Ilina E.N., Shitikov E.A., Ikryannikova L.N., Alekseev D.G., Kamashev D.E., Malakhova M.V. et al. Comparative Genomic Analysis of Mycobacterium tuberculosis Drug Resistant Strains from Russia. PLoS One, 2013, 8(2): e56577.
7.Zimenkov D.V., Antonova O.V., Kuz’min A.V., Isaeva Y.D., Krylova L.Y. et al. Detection of second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays. BMC Infectious Diseases 2013, 13: 240.
8.Rubtsova M.Yu., Ulyashova M.M., Edelstein M.V., Egorov A.M. Oligonucleotide microarrays with horseradish peroxidase-based detection for the identification of extended-spectrum β-lactamases. Biosens. & Bioelectron, 2010, 26, 1252–1260.
9.Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Егоров А.М., Григоренко В.Г., Яминский И.В. Применение атомно-силовой микроскопии для 3D-анализа результатов гибридизации нуклеиновых кислот на микрочипах. Acta Naturae 2015, 7, 117–124.
10.Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Григоренко В.Г., Иванин А.И., Егоров А.М., Яминский И.В. Применение сканирующей зондовой микроскопии в решении задач молекулярной диагностики. Биомедицинская химия 2014, 60, 543–547.
Отзывы читателей
