eng
Выпуск #4/2016
Д.Колесов, И.Яминский, А.Ахметова, О.Синицына, Г.Мешков
Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий
Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий
Просмотры: 4920
Кантилеверные биосенсоры являются многообещающей платформой для создания высокочувствительных и селективных сенсорных устройств. В первой части статьи рассмотрены история вопроса, свойства микрокантилеверов, технологии их производства и биофункционализации, а также способы детекции.
DOI:10.22184/1993-8578.2016.66.4.26.35
DOI:10.22184/1993-8578.2016.66.4.26.35
Теги: biosensor microcantilever scanning probe microscope биосенсор микрокантилевер сканирующий зондовый микроскоп
Кантилевер является основным измерительным элементом атомно-силовой микроскопии [1]. Он представляет собой тонкую длинную пластинку, закрепленную одним концом на массивном чипе с иглой на противоположном конце. Впервые метод фотолитографии для создания микрокантилевера из нитрида кремния был применен Томом Альбрехтом в 1989 году. Сейчас наиболее часто используемыми материалами для производства кантилеверов являются кремний, оксид кремния и нитрид кремния. Ранние исследования по использованию микрокантилеверов для химического детектирования проводились около 20 лет назад в исследовательской лаборатории IBM (Цюрих, Швейцария) и Университете Базеля (Швейцария) [2]. Авторы продемонстрировали статический изгиб кантилевера в результате химической реакции каталитического превращения водорода и кислорода в воду. Первое применение кантилеверных сенсоров для биологических систем было представлено в 1996 году на примере неспецифической адсорбции белка бычьего сывороточного альбумина [3]. С тех пор появилось множество работ, демонстрирующих потенциал микромеханических кантилеверов для создания высокочувствительных химических и биологических сенсоров.
Существуют два основных режима работы кантилеверных сенсоров: статический и динамический (рис.1). Благодаря малой толщине, консоль кантилевера очень чувствительна к латеральным напряжениям, возникающим на ее поверхности. Биоспецифичное связывание молекул аналита с рецепторным слоем на одной из поверхностей кантилевера ведет к возникновению латеральных напряжений в слое, что вызывает изгиб консоли. Напряжения могут быть как стягивающими, так и растягивающими. При этом отклонение свободного конца консоли кантилевера от положения равновесия в простейшем случае связано с латеральным напряжением формулой Стоуни:
,
где ∆σ – изменение поверхностного напряжения, ∆Z – относительное отклонение кантилевера,
υ – коэффициент Пуассона, Е – модуль Юнга материала кантилевера, T и L – его толщина и длина. Таким образом, измеряя отклонение кантилевера в результате биоспецифического связывания, мы можем рассчитать поверхностное напряжение, которое зависит от концентрации искомого вещества в окружающей среде.
Динамический режим работы кантилеверных сенсоров основан на изменении резонансной частоты кантилевера при связывании аналита из раствора. Кантилевер является высокодобротным резонатором, чья резонансная частота зависит от эффективной массы и жесткости консоли. В результате взаимодействия молекул аналита с рецепторным слоем, одна или обе эти характеристики могут изменяться, что может быть зарегистрировано в виде сдвига резонансной частоты кантилевера [4]:
,
где Δf, Δk, Δm – изменения резонансной частоты, жесткости и массы кантилевера, а fn, k и m – первоначальные значения этих параметров.
Разнообразие микрокантилеверов
и их свойства, определяющие возможность использования в качестве биосенсоров
В первых экспериментах по созданию микромеханических сенсоров использовались стандартные коммерческие кантилеверы для зондовой микроскопии. В связи с развитием данного направления появились кантилеверы без иглы для сканирования поверхности, специально адаптированные для использования в биосенсорах. Кантилеверы для статического режима имеют длинную и тонкую консоль с низкой жесткостью. Кантилеверы для резонансного режима характеризуются высокой жесткостью и, соответственно, большей резонансной частотой. Обычно кантилеверы имеют золотое покрытие на одной стороне, которое служит двум целям: улучшает отражательные свойства и обеспечивает селективную модификацию только одной стороны кантилевера. Возможно размещение нескольких консолей на одном чипе для многофакторного анализа.
Благодаря распространению техник фотолитографии многие научные группы создают собственные конфигурации кантилеверов различных форм и размеров для решения конкретных задач. Традиционной формой кантилевера является прямоугольная. При этом возможно различное соотношение длины, ширины и толщины. В статическом режиме латеральные размеры напрямую не влияют на чувствительность датчика, так как поверхностное напряжение изотропно и равномерно по всей его активной поверхности [5]. Однако они могут влиять на чувствительность системы детекции, например, лазерно-оптической системы, в которой измеряется перемещение свободного конца кантилевера, квадратично зависящее от его длины. При этом толщина кантилевера должна быть минимальной. Для резонансных кантилеверов было показано, что уменьшение соотношения длины и ширины при постоянной толщине ведет к повышению чувствительности молекулярного связывания ангиопоэтина-1 в жидкости [6]. Данный результат закономерен, так как от указанного соотношения зависят резонансная частота и добротность.
Кантилеверы могут иметь и не прямоугольную форму. Так, например, треугольные кантилеверы из нитрида кремния имеют меньшую жесткость, а значит более чувствительны в статическом режиме. Изменение формы кантилевера для резонансного режима может иметь следующие предпосылки: изменение моды колебаний, выборочное возбуждение колебаний, увеличение добротности и уменьшение затухания в жидкости и, как результат, увеличение чувствительности. Например, Т-образный пьезоэлектрический резонатор показал чувствительность на уровне фемтограмм [7].
Помимо разных форм, кантилевер может содержать несколько слоев из разных материалов. Часто дополнительные слои применяются для интеграции в датчик системы регистрации или возбуждения колебаний [8]. Активные слои для возбуждения колебаний часто выполнены из пьезоэлектрического или магнитоэластичного материала. Кантилевер может содержать и пассивные слои, разделяющие активные или изменяющие его свойства, например, жесткость. Простейшим вариантом являются биморфы, состоящие из двух слоев одинаковой длины. Более сложными системами являются кантилеверы, содержащие слои разной длины и геометрии. Такие системы имеют внутренние неоднородности, приводящие к уникальным резонансным свойствам [9].
Датчик может представлять собой не просто отдельный кантилевер, но может быть совмещен с другими элементами сенсора, например измерительной камерой. Так, в [10] авторы использовали кантилеверы, совмещенные с микрофлюидным каналом, по которому течет образец (рис.3). С помощью канала, сформированного внутри кантилевера, удалось достичь высокой чувствительности при измерении массы в резонансном режиме [11].
Существуют сенсоры, работающие на основе измерения латеральных напряжений, в которых вместо зафиксированного с одного конца кантилевера используются мембраны, закрепленные по периметру [12] или в нескольких точках. Такие сенсоры имеют ряд преимуществ. Например, обратная сторона мембраны может быть изолирована от контакта с образцом, что уменьшает влияние неспецифического связывания. Было показано, что мембранный сенсор, закрепленный с четырех сторон небольшими "мостиками" (рис.4), имеет более высокую чувствительность по измерению латеральных напряжений по сравнению с обычными кантилеверами [13].
Технологии производства микрокантилеверов
Основной технологией производства микрокантилеверов является фотолитография. Доступны коммерческие кантилеверы из кремния, нитрида кремния или оксида кремния любых форм и размеров длиной от 10 до 500 мкм и толщиной вплоть до 12 нм. Однако для специфических задач, в том числе достижения максимальной чувствительности, кантилеверы должны быть специально разработаны и произведены, чтобы удовлетворять всем требованиям. Кантилеверы изготавливаются с использованием хорошо отработанной тонкопленочной технологии, обеспечивающей низкую стоимость, хороший выход продукции и воспроизводимость. Она включает нанесение тонкой пленки материала, структурирование с помощью фотолитографии и травление, а также последующую микрообработку. Обычно перед основным материалом на подложку наносится защитный слой для облегчения последующего отделения изделия.
Чувствительность кантилеверного сенсора в статическом режиме зависит от модуля Юнга материала кантилевера. Кремний имеет достаточно большое значение модуля Юнга, поэтому кантилеверы, произведенные из более мягких материалов, будут более чувствительными. Распространение получили полимерные материалы, такие как SU-8 и полиметилметакрилат (ПММА). Поскольку они являются фоторезистами, для них подходят технологии прямой фотолитографии, однако могут применяться и другие технологии, например, отливка или трафаретная печать [14]. В работе [15] авторы изготавливали кантилеверы из 6-мкм пленки полиэтилентерефталата, вырезая пластинки необходимой формы при помощи УФ-лазера. В итоге получился массив из трех кантилеверов длиной 600 мкм, шириной 250 мкм и толщиной 6 мкм. На базе таких кантилеверов был создан биосенсор для регистрации одноцепочечной ДНК: одна сторона кантилевера покрывалась слоем золота толщиной 50 нм, на который прикреплялась ДНК, комплементарная к детектируемой. В эксперименте удалось обнаружить концентрации ДНК до 0,01 мкМ в объеме 0,2 мл.
Технологии биофункционализации микрокантилеверов
Сенсорный слой является ключевым элементом кантилеверных сенсоров. Его характеристики определяют чувствительность и селективность биосенсора. Такой слой обычно состоит из рецепторных молекул, обладающих свойством биоспецифического связывания, и вспомогательных молекул, обеспечивающих надежную фиксацию и правильное расположение рецепторов. Антитела и нуклеиновые кислоты (ДНК-зонды) являются наиболее часто используемыми рецепторными молекулами для детекции патогенных агентов.
Физическая сорбция – простейший способ иммобилизации антител на поверхности кантилевера, при этом их активность может снизиться в результате денатурации или неправильной ориентации. Регенерация подобных сенсорных слоев также представляется затруднительной, так как физически адсорбированные молекулы могут быть легко смыты. Более предпочтительна ковалентная пришивка антител, при которой используются вспомогательные молекулы, выполняющие роль линкеров.
Для создания на поверхности кантилевера сенсорного слоя часто используются самоорганизующиеся монослои (СОМ) на основе тиолов [16] для золотой поверхности или силатранов [17] – для кремниевой. Соединения на основе органосиланов создают развитую поверхность. Для достижения наилучшей активности в качестве рецепторов могут использоваться только Fab-фрагменты антител [18]. Олигонуклеотиды могут быть легко модифицированы тиольной группой и пришиты напрямую на золотую поверхность кантилевера [19].
Нанесение сенсорного слоя может осуществляться путем полного погружения кантилевера в модифицирующий раствор [20], однако данный способ неприменим, если кантилевер имеет несколько консолей. Модификация каждой консоли разными веществами является трудной задачей. Одно из решений – использование набора капилляров подходящего размера для каждой консоли [21]. Технология микропечати, аналогичная применяемой при создании ДНК чипов, также пригодна для нанесения сенсорного слоя [22].
Способы детекции с использованием микрокантилеверов
Основным способом детекции отклонения кантилевера от положения равновесия является оптический (рис.5), который, как и сам кантилевер, пришел из зондовой микроскопии. Лазерный луч направляется на кончик консоли кантилевера и, отражаясь от него, попадает на детектор положения. Детектором может служить чувствительный фотодиод [23] или ПЗС-камера [24]. При отклонении кантилевера от первоначального положения, отраженный луч перемещается по детектору, причем его перемещение усиливается за счет "оптического плеча". Такой метод регистрации является чрезвычайно точным, позволяя детектировать даже субнанометровые перемещения, но имеет и ряд недостатков, например, довольно большие геометрические размеры системы, так как необходимость усиливать перемещение луча по фотодиоду приводит к увеличению расстояния от кантилевера до детектора. Кроме того, сфокусированное лазерное излучение может служить причиной локального нагрева образца и датчика. Для достижения максимальной чувствительности необходимо использовать качественные источник излучения и детектор, что делает всю систему достаточно дорогостоящей.
Альтернативным методом детекции, получившим распространение в последнее десятилетие благодаря высокому уровню развития литографических техник, является пьезорезистивная система. Она основана на изменении сопротивления датчика, находящегося на поверхности кантилевера, в ответ на возникновение поверхностного напряжения при изгибе консоли. Таким датчиком может служить простой золотой электрод нанометровой толщины, нанесенный на поверхность кантилевера (рис.6). Часто для измерений с помощью пьезорезистивного кантилевера применяется электрическая схема на основе моста Уитстона [25]. Данный метод обладает большим потенциалом для создания компактных сенсорных устройств с высокой степенью интеграции, однако обычно обладает на порядок меньшей чувствительностью. Также для производства кантилеверов со встроенным пьезорезистивным датчиком требуется специальное оборудование, что оправдано только при большом объеме производства.
Другие методы детекции не получили широкого распространения. Например, емкостной метод, основанный на измерении емкости плоского конденсатора, одной из обкладок которого является микрокантилеверный датчик [26], позволяет с высокой точностью регистрировать изгиб кантилевера, однако не применим в растворах электролитов. Также существует оптический метод, основанный на интерференции отраженного от кантилевера луча с опорным лазерным лучом [27, 28]. Сколотый конец оптического волокна помещается вблизи поверхности кантилевера, и одна часть излучения отражается от границы оптоволокна и среды, а вторая – от поверхности кантилевера. Эти два излучения интерферируют внутри волокна и интерференционный сигнал может быть измерен фотодетектором. Данный метод является чрезвычайно чувствительным, позволяя измерять отклонения до 0,1 Å, но не подходит для больших перемещений и сложен из-за необходимости очень точно позиционировать оптоволокно.
Оптические методы детекции отличаются самым большим разнообразием. Кантилевер сам может выступать в качестве волновода [29]. Его отклонение может быть зарегистрировано с помощью дифракционной решетки или по изменению интерференционной картины на его поверхности.
В работе [30] продемонстрирован интересный подход к измерению поверхностного напряжения путем встраивания полевого транзистора на основе перехода металл-оксид-полупроводник в основание кантилевера. Затвор полевого транзистора увеличивается с возникновением поверхностного напряжения, вызывая уменьшение тока стока при отклонении. Авторы исследования декларируют низкий шум и высокую чувствительность данного метода.
Продолжение в следующем номере.
Наша искренняя благодарность РФФИ (проект 15-04-07678) и Министерству образования и науки за финансовую поддержку (проект 02.G25.31.0135)
Литература
1.Колесов Д.В., Яминский И.В. Кантилеверы для сканирующей зондовой микроскопии // Нано- и микросистемная техника. 2007. № 11(86). С. 5–11.
1.Gimzewski J.K., Gerber C., Meyer E., Schlittler R.R. Observation of a chemical reaction using a micromechanical sensor // Chem. Phys. Lett. 1994. 217. Р. 589–594.
1.Butt H.-J. A Sensitive Method to Measure Changes in the Surface Stress of Solids // J. Colloid Interface Sci. 1996. 180. Р. 251–260.
1.Chen G.Y., Thundat T., Wachter E.A., Warmack R.J. J. Appl. Phys. 1995. 77 (8). 3618–3622.
1.Sang S. et al. Surface stress-basedbiosensors Biosensors and Bioelectronics, 51(2014), 124–135.
1.Ricciardi C., Canavese G., Castagna R., Ferrante I., Ricci A., Marasso S.L., Napione L., Bussolino F. Biosens. Bioelectron. 2010. № 26(4). Р. 1565–1570.
1.Pang W., Yan L., Zhang H., Yu H.Y., Kim E.S., Tang W.C. 2006. Appl. Phys. Lett. 88 (24). 243503.
1.Hwang K.S., Lee J.H., Park J., Yoon D.S., Park J.H., Kim T.S. 2004. Lab. Chip. 4(6), 547–552.
1.Johnson B.N., Mutharasan, R., 2011a. Sens. Actuators 155 (2), 868–877.
1.Nordström M., Zauner D.A., Calleja M., Hübner J., Boisen A. Integrated optical readout for miniaturization of cantilever-based sensor system// Appl. Phys. Lett. 91, 103512 2007.
1.Burg T.P. et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature 446, 1066–1069 (2007).
1.Chatzipetrou M., Tsekenis G., Tsouti V., Chatzandroulis S., Zergioti I. 2013. Applied SurfaceScience 278, 250–254.
1.Yoshikawa G., Akiyama T.,Loizeau F., Shiba K., Gautsch S., Nakayama T., Vettiger P., Rooij N., Aono M. 2012. Sensors 12,15873–15887.
1.Lucat C., Ginet P., Ménil F. New Sacrificial Layer Based Screen-Printing Process for Free-Standing Thick-Films Applied to MEMS, Inter. Journal of microelectronic and electronic packaging. 2007. 4. 86–92.
1.Zhang X.R., Xu X. Development of a biosensor based on laser-fabricated polymer microcantilevers. Appl. Phys. Lett. 2004. 85(12). РР. 2423–2425.
1.Berger R. et al. Surface stress in the self-assembly of alkanethiols on gold, Science. 1997. 276. 2021.
1.Hsieh S., Hsieh S.-L., Hsieh C., Lin P.-Ch., Wu Ch.-H. Label-Free Glucose Detection Using Cantilever Sensor Technology Based on Gravimetric Detection Principles, Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013. Vol. 2013, Article ID 687265, 5 pages.
1.Rao S.V., Anderson K.W., Bachas L.G. (1998) Oriented immobilization of proteins. Mikrochim Acta 128 : 127–143.
1.Hagan M.F., Majumdar A., Chakraborty A.K. (2002) Nanomechanical forces generated by surface grafted DNA. J Phys Chem B 106 : 10163–10173.
1.Fritz J., Baller M.K., Lang H.P., Strunz T., Meyer E., Guntherodt H.-J., Delamarche E., Gerber Ch. and Gimzewski J.K. 2000 Langmuir 16 9694.
1.McKendry R., Zhang J., Arntz Y., Strunz T., Hegner M., Lang H.P., Baller M.K., Certa U., Meyer E., Güntherodt H.J., Gerber C. Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2002 Jul 23; 99(15) : 9783-8.
1.Bietsch A. et al. Rapid functionalization of cantilever array sensors by inkjet printing // Nanotechnology. 2004. 15(8). 873.
1.Meyer G., Amer N.M. (1988) Novel optical approach to atomic force microscopy // Appl. Phys. Lett., 53(12), 1045-47.
1.Kim B.H., Mader O., Weimar U., Brock R. & Kern D.P. (2003) Detection of antibody peptide interaction using microcantilevers as surface stress sensors. J. Vac. Sci. Technol. B, 21(4), 1472-1475.
1.Nordström M., Keller S., Lillemose M., Johansson A., Dohn S., Haefliger D., Blagoi G., Havsteen-Jakobsen M., Boise A. SU-8 Cantilevers for Bio/chemical Sensing; Fabrication, Characterisation and Development of Novel Read-out Methods // Sensors 2008. 8(3). 1595–1612.
1.Blanc N., Brugger J., Rooij N.F.D., Durig U. (1996) Scanning Force Microscopy in the Dynamic Mode Using Microfabricated Capacitive Sensors // J Vac. Sci. Technol. B, 14(2), 901-05.
1.Erlandsson R., McClelland G.M., Mate C.M., Chiang S. (1988) Atomic force microscopy using optical interferometry // J. Vac. Sci. Technol. A, 6(2), 266-70.
1.Rugar D., Mamin H.J., Guethner P. (1989) Improved fiber-optic interferometer for atomic force microscopy // Appl. Phys. Lett., 55(25), 2588-90.
1.Zinoviev K., Domínguez C., Plaza J.A., Cadalso Busto V.J., Lechuga L.M. A novel optical waveguide microcantilever sensor for the detection of nanomechanical forces // J. Lightw. Technol. 2006. 24. 2133–2138.
1.Shekhawat G., Tark S.H., Dravid V.P. MOSFET-embedded microcantilevers for measuring deflection in biomolecular sensors // Science. 2009. 311 : 1592–95.
Существуют два основных режима работы кантилеверных сенсоров: статический и динамический (рис.1). Благодаря малой толщине, консоль кантилевера очень чувствительна к латеральным напряжениям, возникающим на ее поверхности. Биоспецифичное связывание молекул аналита с рецепторным слоем на одной из поверхностей кантилевера ведет к возникновению латеральных напряжений в слое, что вызывает изгиб консоли. Напряжения могут быть как стягивающими, так и растягивающими. При этом отклонение свободного конца консоли кантилевера от положения равновесия в простейшем случае связано с латеральным напряжением формулой Стоуни:
,
где ∆σ – изменение поверхностного напряжения, ∆Z – относительное отклонение кантилевера,
υ – коэффициент Пуассона, Е – модуль Юнга материала кантилевера, T и L – его толщина и длина. Таким образом, измеряя отклонение кантилевера в результате биоспецифического связывания, мы можем рассчитать поверхностное напряжение, которое зависит от концентрации искомого вещества в окружающей среде.
Динамический режим работы кантилеверных сенсоров основан на изменении резонансной частоты кантилевера при связывании аналита из раствора. Кантилевер является высокодобротным резонатором, чья резонансная частота зависит от эффективной массы и жесткости консоли. В результате взаимодействия молекул аналита с рецепторным слоем, одна или обе эти характеристики могут изменяться, что может быть зарегистрировано в виде сдвига резонансной частоты кантилевера [4]:
,
где Δf, Δk, Δm – изменения резонансной частоты, жесткости и массы кантилевера, а fn, k и m – первоначальные значения этих параметров.
Разнообразие микрокантилеверов
и их свойства, определяющие возможность использования в качестве биосенсоров
В первых экспериментах по созданию микромеханических сенсоров использовались стандартные коммерческие кантилеверы для зондовой микроскопии. В связи с развитием данного направления появились кантилеверы без иглы для сканирования поверхности, специально адаптированные для использования в биосенсорах. Кантилеверы для статического режима имеют длинную и тонкую консоль с низкой жесткостью. Кантилеверы для резонансного режима характеризуются высокой жесткостью и, соответственно, большей резонансной частотой. Обычно кантилеверы имеют золотое покрытие на одной стороне, которое служит двум целям: улучшает отражательные свойства и обеспечивает селективную модификацию только одной стороны кантилевера. Возможно размещение нескольких консолей на одном чипе для многофакторного анализа.
Благодаря распространению техник фотолитографии многие научные группы создают собственные конфигурации кантилеверов различных форм и размеров для решения конкретных задач. Традиционной формой кантилевера является прямоугольная. При этом возможно различное соотношение длины, ширины и толщины. В статическом режиме латеральные размеры напрямую не влияют на чувствительность датчика, так как поверхностное напряжение изотропно и равномерно по всей его активной поверхности [5]. Однако они могут влиять на чувствительность системы детекции, например, лазерно-оптической системы, в которой измеряется перемещение свободного конца кантилевера, квадратично зависящее от его длины. При этом толщина кантилевера должна быть минимальной. Для резонансных кантилеверов было показано, что уменьшение соотношения длины и ширины при постоянной толщине ведет к повышению чувствительности молекулярного связывания ангиопоэтина-1 в жидкости [6]. Данный результат закономерен, так как от указанного соотношения зависят резонансная частота и добротность.
Кантилеверы могут иметь и не прямоугольную форму. Так, например, треугольные кантилеверы из нитрида кремния имеют меньшую жесткость, а значит более чувствительны в статическом режиме. Изменение формы кантилевера для резонансного режима может иметь следующие предпосылки: изменение моды колебаний, выборочное возбуждение колебаний, увеличение добротности и уменьшение затухания в жидкости и, как результат, увеличение чувствительности. Например, Т-образный пьезоэлектрический резонатор показал чувствительность на уровне фемтограмм [7].
Помимо разных форм, кантилевер может содержать несколько слоев из разных материалов. Часто дополнительные слои применяются для интеграции в датчик системы регистрации или возбуждения колебаний [8]. Активные слои для возбуждения колебаний часто выполнены из пьезоэлектрического или магнитоэластичного материала. Кантилевер может содержать и пассивные слои, разделяющие активные или изменяющие его свойства, например, жесткость. Простейшим вариантом являются биморфы, состоящие из двух слоев одинаковой длины. Более сложными системами являются кантилеверы, содержащие слои разной длины и геометрии. Такие системы имеют внутренние неоднородности, приводящие к уникальным резонансным свойствам [9].
Датчик может представлять собой не просто отдельный кантилевер, но может быть совмещен с другими элементами сенсора, например измерительной камерой. Так, в [10] авторы использовали кантилеверы, совмещенные с микрофлюидным каналом, по которому течет образец (рис.3). С помощью канала, сформированного внутри кантилевера, удалось достичь высокой чувствительности при измерении массы в резонансном режиме [11].
Существуют сенсоры, работающие на основе измерения латеральных напряжений, в которых вместо зафиксированного с одного конца кантилевера используются мембраны, закрепленные по периметру [12] или в нескольких точках. Такие сенсоры имеют ряд преимуществ. Например, обратная сторона мембраны может быть изолирована от контакта с образцом, что уменьшает влияние неспецифического связывания. Было показано, что мембранный сенсор, закрепленный с четырех сторон небольшими "мостиками" (рис.4), имеет более высокую чувствительность по измерению латеральных напряжений по сравнению с обычными кантилеверами [13].
Технологии производства микрокантилеверов
Основной технологией производства микрокантилеверов является фотолитография. Доступны коммерческие кантилеверы из кремния, нитрида кремния или оксида кремния любых форм и размеров длиной от 10 до 500 мкм и толщиной вплоть до 12 нм. Однако для специфических задач, в том числе достижения максимальной чувствительности, кантилеверы должны быть специально разработаны и произведены, чтобы удовлетворять всем требованиям. Кантилеверы изготавливаются с использованием хорошо отработанной тонкопленочной технологии, обеспечивающей низкую стоимость, хороший выход продукции и воспроизводимость. Она включает нанесение тонкой пленки материала, структурирование с помощью фотолитографии и травление, а также последующую микрообработку. Обычно перед основным материалом на подложку наносится защитный слой для облегчения последующего отделения изделия.
Чувствительность кантилеверного сенсора в статическом режиме зависит от модуля Юнга материала кантилевера. Кремний имеет достаточно большое значение модуля Юнга, поэтому кантилеверы, произведенные из более мягких материалов, будут более чувствительными. Распространение получили полимерные материалы, такие как SU-8 и полиметилметакрилат (ПММА). Поскольку они являются фоторезистами, для них подходят технологии прямой фотолитографии, однако могут применяться и другие технологии, например, отливка или трафаретная печать [14]. В работе [15] авторы изготавливали кантилеверы из 6-мкм пленки полиэтилентерефталата, вырезая пластинки необходимой формы при помощи УФ-лазера. В итоге получился массив из трех кантилеверов длиной 600 мкм, шириной 250 мкм и толщиной 6 мкм. На базе таких кантилеверов был создан биосенсор для регистрации одноцепочечной ДНК: одна сторона кантилевера покрывалась слоем золота толщиной 50 нм, на который прикреплялась ДНК, комплементарная к детектируемой. В эксперименте удалось обнаружить концентрации ДНК до 0,01 мкМ в объеме 0,2 мл.
Технологии биофункционализации микрокантилеверов
Сенсорный слой является ключевым элементом кантилеверных сенсоров. Его характеристики определяют чувствительность и селективность биосенсора. Такой слой обычно состоит из рецепторных молекул, обладающих свойством биоспецифического связывания, и вспомогательных молекул, обеспечивающих надежную фиксацию и правильное расположение рецепторов. Антитела и нуклеиновые кислоты (ДНК-зонды) являются наиболее часто используемыми рецепторными молекулами для детекции патогенных агентов.
Физическая сорбция – простейший способ иммобилизации антител на поверхности кантилевера, при этом их активность может снизиться в результате денатурации или неправильной ориентации. Регенерация подобных сенсорных слоев также представляется затруднительной, так как физически адсорбированные молекулы могут быть легко смыты. Более предпочтительна ковалентная пришивка антител, при которой используются вспомогательные молекулы, выполняющие роль линкеров.
Для создания на поверхности кантилевера сенсорного слоя часто используются самоорганизующиеся монослои (СОМ) на основе тиолов [16] для золотой поверхности или силатранов [17] – для кремниевой. Соединения на основе органосиланов создают развитую поверхность. Для достижения наилучшей активности в качестве рецепторов могут использоваться только Fab-фрагменты антител [18]. Олигонуклеотиды могут быть легко модифицированы тиольной группой и пришиты напрямую на золотую поверхность кантилевера [19].
Нанесение сенсорного слоя может осуществляться путем полного погружения кантилевера в модифицирующий раствор [20], однако данный способ неприменим, если кантилевер имеет несколько консолей. Модификация каждой консоли разными веществами является трудной задачей. Одно из решений – использование набора капилляров подходящего размера для каждой консоли [21]. Технология микропечати, аналогичная применяемой при создании ДНК чипов, также пригодна для нанесения сенсорного слоя [22].
Способы детекции с использованием микрокантилеверов
Основным способом детекции отклонения кантилевера от положения равновесия является оптический (рис.5), который, как и сам кантилевер, пришел из зондовой микроскопии. Лазерный луч направляется на кончик консоли кантилевера и, отражаясь от него, попадает на детектор положения. Детектором может служить чувствительный фотодиод [23] или ПЗС-камера [24]. При отклонении кантилевера от первоначального положения, отраженный луч перемещается по детектору, причем его перемещение усиливается за счет "оптического плеча". Такой метод регистрации является чрезвычайно точным, позволяя детектировать даже субнанометровые перемещения, но имеет и ряд недостатков, например, довольно большие геометрические размеры системы, так как необходимость усиливать перемещение луча по фотодиоду приводит к увеличению расстояния от кантилевера до детектора. Кроме того, сфокусированное лазерное излучение может служить причиной локального нагрева образца и датчика. Для достижения максимальной чувствительности необходимо использовать качественные источник излучения и детектор, что делает всю систему достаточно дорогостоящей.
Альтернативным методом детекции, получившим распространение в последнее десятилетие благодаря высокому уровню развития литографических техник, является пьезорезистивная система. Она основана на изменении сопротивления датчика, находящегося на поверхности кантилевера, в ответ на возникновение поверхностного напряжения при изгибе консоли. Таким датчиком может служить простой золотой электрод нанометровой толщины, нанесенный на поверхность кантилевера (рис.6). Часто для измерений с помощью пьезорезистивного кантилевера применяется электрическая схема на основе моста Уитстона [25]. Данный метод обладает большим потенциалом для создания компактных сенсорных устройств с высокой степенью интеграции, однако обычно обладает на порядок меньшей чувствительностью. Также для производства кантилеверов со встроенным пьезорезистивным датчиком требуется специальное оборудование, что оправдано только при большом объеме производства.
Другие методы детекции не получили широкого распространения. Например, емкостной метод, основанный на измерении емкости плоского конденсатора, одной из обкладок которого является микрокантилеверный датчик [26], позволяет с высокой точностью регистрировать изгиб кантилевера, однако не применим в растворах электролитов. Также существует оптический метод, основанный на интерференции отраженного от кантилевера луча с опорным лазерным лучом [27, 28]. Сколотый конец оптического волокна помещается вблизи поверхности кантилевера, и одна часть излучения отражается от границы оптоволокна и среды, а вторая – от поверхности кантилевера. Эти два излучения интерферируют внутри волокна и интерференционный сигнал может быть измерен фотодетектором. Данный метод является чрезвычайно чувствительным, позволяя измерять отклонения до 0,1 Å, но не подходит для больших перемещений и сложен из-за необходимости очень точно позиционировать оптоволокно.
Оптические методы детекции отличаются самым большим разнообразием. Кантилевер сам может выступать в качестве волновода [29]. Его отклонение может быть зарегистрировано с помощью дифракционной решетки или по изменению интерференционной картины на его поверхности.
В работе [30] продемонстрирован интересный подход к измерению поверхностного напряжения путем встраивания полевого транзистора на основе перехода металл-оксид-полупроводник в основание кантилевера. Затвор полевого транзистора увеличивается с возникновением поверхностного напряжения, вызывая уменьшение тока стока при отклонении. Авторы исследования декларируют низкий шум и высокую чувствительность данного метода.
Продолжение в следующем номере.
Наша искренняя благодарность РФФИ (проект 15-04-07678) и Министерству образования и науки за финансовую поддержку (проект 02.G25.31.0135)
Литература
1.Колесов Д.В., Яминский И.В. Кантилеверы для сканирующей зондовой микроскопии // Нано- и микросистемная техника. 2007. № 11(86). С. 5–11.
1.Gimzewski J.K., Gerber C., Meyer E., Schlittler R.R. Observation of a chemical reaction using a micromechanical sensor // Chem. Phys. Lett. 1994. 217. Р. 589–594.
1.Butt H.-J. A Sensitive Method to Measure Changes in the Surface Stress of Solids // J. Colloid Interface Sci. 1996. 180. Р. 251–260.
1.Chen G.Y., Thundat T., Wachter E.A., Warmack R.J. J. Appl. Phys. 1995. 77 (8). 3618–3622.
1.Sang S. et al. Surface stress-basedbiosensors Biosensors and Bioelectronics, 51(2014), 124–135.
1.Ricciardi C., Canavese G., Castagna R., Ferrante I., Ricci A., Marasso S.L., Napione L., Bussolino F. Biosens. Bioelectron. 2010. № 26(4). Р. 1565–1570.
1.Pang W., Yan L., Zhang H., Yu H.Y., Kim E.S., Tang W.C. 2006. Appl. Phys. Lett. 88 (24). 243503.
1.Hwang K.S., Lee J.H., Park J., Yoon D.S., Park J.H., Kim T.S. 2004. Lab. Chip. 4(6), 547–552.
1.Johnson B.N., Mutharasan, R., 2011a. Sens. Actuators 155 (2), 868–877.
1.Nordström M., Zauner D.A., Calleja M., Hübner J., Boisen A. Integrated optical readout for miniaturization of cantilever-based sensor system// Appl. Phys. Lett. 91, 103512 2007.
1.Burg T.P. et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature 446, 1066–1069 (2007).
1.Chatzipetrou M., Tsekenis G., Tsouti V., Chatzandroulis S., Zergioti I. 2013. Applied SurfaceScience 278, 250–254.
1.Yoshikawa G., Akiyama T.,Loizeau F., Shiba K., Gautsch S., Nakayama T., Vettiger P., Rooij N., Aono M. 2012. Sensors 12,15873–15887.
1.Lucat C., Ginet P., Ménil F. New Sacrificial Layer Based Screen-Printing Process for Free-Standing Thick-Films Applied to MEMS, Inter. Journal of microelectronic and electronic packaging. 2007. 4. 86–92.
1.Zhang X.R., Xu X. Development of a biosensor based on laser-fabricated polymer microcantilevers. Appl. Phys. Lett. 2004. 85(12). РР. 2423–2425.
1.Berger R. et al. Surface stress in the self-assembly of alkanethiols on gold, Science. 1997. 276. 2021.
1.Hsieh S., Hsieh S.-L., Hsieh C., Lin P.-Ch., Wu Ch.-H. Label-Free Glucose Detection Using Cantilever Sensor Technology Based on Gravimetric Detection Principles, Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013. Vol. 2013, Article ID 687265, 5 pages.
1.Rao S.V., Anderson K.W., Bachas L.G. (1998) Oriented immobilization of proteins. Mikrochim Acta 128 : 127–143.
1.Hagan M.F., Majumdar A., Chakraborty A.K. (2002) Nanomechanical forces generated by surface grafted DNA. J Phys Chem B 106 : 10163–10173.
1.Fritz J., Baller M.K., Lang H.P., Strunz T., Meyer E., Guntherodt H.-J., Delamarche E., Gerber Ch. and Gimzewski J.K. 2000 Langmuir 16 9694.
1.McKendry R., Zhang J., Arntz Y., Strunz T., Hegner M., Lang H.P., Baller M.K., Certa U., Meyer E., Güntherodt H.J., Gerber C. Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2002 Jul 23; 99(15) : 9783-8.
1.Bietsch A. et al. Rapid functionalization of cantilever array sensors by inkjet printing // Nanotechnology. 2004. 15(8). 873.
1.Meyer G., Amer N.M. (1988) Novel optical approach to atomic force microscopy // Appl. Phys. Lett., 53(12), 1045-47.
1.Kim B.H., Mader O., Weimar U., Brock R. & Kern D.P. (2003) Detection of antibody peptide interaction using microcantilevers as surface stress sensors. J. Vac. Sci. Technol. B, 21(4), 1472-1475.
1.Nordström M., Keller S., Lillemose M., Johansson A., Dohn S., Haefliger D., Blagoi G., Havsteen-Jakobsen M., Boise A. SU-8 Cantilevers for Bio/chemical Sensing; Fabrication, Characterisation and Development of Novel Read-out Methods // Sensors 2008. 8(3). 1595–1612.
1.Blanc N., Brugger J., Rooij N.F.D., Durig U. (1996) Scanning Force Microscopy in the Dynamic Mode Using Microfabricated Capacitive Sensors // J Vac. Sci. Technol. B, 14(2), 901-05.
1.Erlandsson R., McClelland G.M., Mate C.M., Chiang S. (1988) Atomic force microscopy using optical interferometry // J. Vac. Sci. Technol. A, 6(2), 266-70.
1.Rugar D., Mamin H.J., Guethner P. (1989) Improved fiber-optic interferometer for atomic force microscopy // Appl. Phys. Lett., 55(25), 2588-90.
1.Zinoviev K., Domínguez C., Plaza J.A., Cadalso Busto V.J., Lechuga L.M. A novel optical waveguide microcantilever sensor for the detection of nanomechanical forces // J. Lightw. Technol. 2006. 24. 2133–2138.
1.Shekhawat G., Tark S.H., Dravid V.P. MOSFET-embedded microcantilevers for measuring deflection in biomolecular sensors // Science. 2009. 311 : 1592–95.
Отзывы читателей
