eng
Выпуск #5/2016
Д.Колесов, И.Яминский, А.Ахметова, О.Синицына, Г.Мешков
Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий
Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий
Просмотры: 5155
Продолжая рассказ о кантилеверных биосенсорах, во второй части статьи (начало см. "Наноиндустрия", 2016, № 4(66), с. 26–35) рассмотрены варианты интеграции кантилеверных сенсоров в состав биоаналитических устройств и соответствующие им области применения, примеры биосенсоров для детекции биомолекул, преимущества и недостатки биосенсоров на основе микрокантилеверов, а также актуальные направления исследований.
DOI:10.22184/1993-8578.2016.67.5.26.34
DOI:10.22184/1993-8578.2016.67.5.26.34
Кантилеверные биосенсоры являются многообещающей платформой для создания высокочувствительных и селективных сенсорных устройств.
ВАРИАНТЫ ИНТЕГРАЦИИ В СОСТАВ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ
Благодаря своей компактности, кантилеверные сенсоры могут легко встраиваться в состав комплексных биоаналитических устройств. Часто такая интеграция осуществляется в микрофлюидном формате [1]. Микрофлюидный чип позволяет прецизионно управлять маленьким объемом жидкого образца, последовательно обеспечивая стадии пробоподготовки и анализа. Такие комплексные системы называют "система полного микроанализа" или "лаборатория-на-чипе". Кантилеверные сенсоры также могут быть объединены с другими типами сенсоров для проведения более полного анализа. В [2] кантилеверный резонансный сенсор был совмещен с емкостным и калориметрическим датчиками с целью создания газового сенсора для анализа содержащихся в воздухе летучих органических соединений (рис.1). Полная интеграция микроэлектронных и микромеханических компонентов на одном чипе обеспечивает управление и мониторинг функций датчика, а также повышает его общую производительность благодаря усилению сигнала. Схема также включает аналого-цифровые преобразователи и интерфейс передачи данных на внешний модуль записи.
Кантилеверные сенсоры могут интегрироваться со средствами беспроводной передачи данных для создания полностью автономных устройств. Авторы работы [3] разработали и создали кантилеверный сенсор для определения С-реактивного белка с интегрированным беспроводным модулем. Подобные устройства могут быть прототипами имплантируемых сенсоров (рис.2), которые впервые удалось создать относительно недавно [4]. Так как регенерация биосенсора довольно трудна, имплантируемое устройство было использовано для детекции газов крови, например спиртов. Для этого на обратную сторону кантилевера было нанесено гидрофобное покрытие, а золотую сторону модифицировали полимерным тиолированным фторсилоксановым спиртом. Поглощение спирта рецепторным слоем приводит к изгибу кантилевера.
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСЕНСОРОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВАРИАНТА ИНТЕГРАЦИИ
Основным направлением применения биосенсоров является диагностика. Кантилеверные сенсоры позволяют определять белки, являющиеся маркерами различных заболеваний. Например, показана возможность детектирования простат-специфического антигена – маркера заболеваний предстательной железы – на клинически значимом уровне концентраций [5]. В другой работе [6] определялась концентрация миоглобина, являющегося маркером сердечно-сосудистых заболеваний. Многие тесты требуют значительного времени, специально обученного персонала и похода в лабораторию. Компактные и автономные сенсорные устройства на основе микрокантилеверов, интегрированных в микрофлюидные чипы, имеют перспективы для использования в качестве устройств персонализированной диагностики [7]. Время отклика подобных устройств составляет десятки минут. Стационарные приборы могут использоваться в клинических лабораториях в качестве альтернативы или дополнения к стандартным методам диагностики.
Однако диагностика является не единственным применением кантилеверных сенсоров. Основанный на массиве из нескольких кантилеверных датчиков "электронный нос" может применяться для мониторинга окружающей среды. Используя восьмикантилеверный датчик с консолями, покрытыми различными полимерами, авторы [8] показали возможность различать в воздухе "запахи" различных спиртов.
Хотя большинство исследований оперируют данными от одного или нескольких сенсорных кантилеверов, уже показана возможность изготовления тысяч кантилеверов на одном чипе в несколько миллиметров. Компания IBM продемонстрировала размещение 100 кантилеверов на 1 мм2. Таким образом, по плотности упаковки сенсорных элементов кантилеверные датчики приближаются к ДНК-микрочипам. При этом такие чипы не требуют флуоресцентных меток. Основной проблемой остается функционализация такого количества кантилеверов рецепторными молекулами.
ПРИМЕРЫ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БИОМОЛЕКУЛ
За время развития кантилеверных биосенсоров продемонстрировано большое количество приложений по детекции различных видов биомолекул: белков [5, 6], нуклеиновых кислот, углеводов [9]. Была показана возможность зарегистрировать единичный нуклеотидный полиморфизм [10].
Особый интерес представляет разработка сенсоров, чувствительных к биологическим объектам, представляющим опасность для здоровья человека. Патогенные агенты могут быть детектированы с помощью кантилеверных сенсоров как напрямую, так и по анализу их генома, продуктов выделения или токсинов.
Определение наличия целых патогенных клеток часто используется для детекции бактерий. Одним из популярных объектов для отработки метода (в значительной степени благодаря ее наличию в различных образцах еды и воды) является E.coli. Эта бактерия может служить индикатором качества воды [11]. Детектирование отдельной клетки E.coli было продемонстрировано с помощью кантилеверного сенсора в резонансном режиме [12] (рис.3). Однако в данной работе для повышения чувствительности измерения проводились в вакууме и требовалась стадия сушки. Данное ограничение может быть преодолено благодаря применению кантилеверов с внутренним каналом, который может работать в вакууме, при этом анализируя жидкость в канале [13]. В другой работе пьезоэлектрический кантилевер миллиметрового размера был использован для определения E.coli в буферном растворе с пределом обнаружения 700 клеток/мл [14]. Он позволял вести измерения непосредственно в жидкости с получением данных практически в режиме реального времени.
Использование статического режима показало значительно худший предел обнаружения около 106 КОЕ/мл [15]. Видимо связывание таких больших объектов как бактерии не создает на поверхности равномерного поверхностного напряжения. Для бактерии S.Typhimurium кантилевер в резонансном режиме показал предел обнаружения на уровне 5∙103 клеток/мл [16], а в режиме измерения поверхностного напряжения – 106 КОЕ/мл [17]. Кэмпбелл и соавторы использовали кантилевер, модифицированный поликлональными антителами к бактерии B. Anthracis, для измерения в потоке и показали чувствительность в 300 спор/мл [18]. В другом исследовании [19] с использованием кантилеверного сенсора было зарегистрировано 50 спор в воде.
В последние несколько лет популярным стало создание биосенсоров для детектирования вирусов в окружающей среде. Гепатит является одним из самых опасных вирусных заболеваний в мире. Тимурдоган с соавторами [20] использовали кантилеверный биосенсор для определения вирусов гепатита А и С в бычьей сыворотке. Антитела к гепатитам А и С были иммобилизованы на разных кантилеверах, предел обнаружения составил 0,1 нг/мл (1,6 пМ). Гупта в работе [21] показал, что чувствительности кантилевера по измерению массы достаточно, чтобы взвесить отдельный вирус коровьей оспы, однако он не использовал специфичного сенсорного слоя.
В работе [22] было показано детектирование в статическом режиме вируса утиного гриппа А с помощью кантилевера, модифицированного синтетически гликополимером, содержащим остатки сиаловых кислот. Авторы полагают, что слой полимера на поверхности кантилевера создавал матрикс, который усиливал поверхностное натяжение за счет дополнительного взаимодействия с вирусными частицами. Предел обнаружения в данной системе составил 106 вирионов/мл.
Пьезоэлектрический кантилеверный сенсор, работающий в резонансном режиме, был использован для детектирования хеликазы вируса гепатита С с концентрацией 100 пг/мл [23]. Хеликаза является ферментом, отвечающим за развертывание вирусной РНК и специфична для данного вируса. В качестве рецептора были использованы РНК аптамеры – короткие последовательности нуклеотидов, способные специфически связывать антиген (белок). Их можно легко синтезировать, и они более стабильны при хранении, чем антитела.
Другим вариантом детектирования патогенных агентов является определение наличия их нуклеиновых кислот в образце. В отличие от крупных объектов, ДНК и РНК не обладают значительной массой, но было показано, что связывание нуклеиновых кислот с комплиментарными молекулами на поверхности кантилевера вызывает значительное поверхностное напряжение. Было продемонстрировано детектирование неамплифицированной матричной РНК в общей массе РНК клетки с пределом обнаружения 10 пмоль. С использованием микрокантилеверного сенсора и усиления с помощью кремниевых наночастиц удалось достичь определения ДНК вируса гепатита В на фемтомолярном уровне [24]. Фрагмент ДНК вируса длиной 243 нуклеотида был детектирован с помощью зонда на уровне пикомолей. Дальнейшее увеличение чувствительности до фемтомолей было получено за счет гибридизации со вторым зондом, содержащим наночастицу.
В работе [25] описано детектирование производящей токсины цианобактерии M. aeruginosa по видоспецифичному участку гена 16S рибосомальной РНК на уровне концентрации 50 клеток/мл. Для этого на кантилевере были иммобилизованы ДНК олигонуклеотиды, содержащие 27 оснований, комплиментарные к искомому участку генома. Сенсор фиксировал сдвиг резонансной частоты кантилевера, вызванный гибридизацией молекул комплиментарных ДНК, пропорциональный концентрации бактерий в растворе. Достоверность гибридизации была подтверждена флуоресцентными измерениями и вторичной гибридизацией ДНК-зондов с пришитой наночастицей золота.
Пьезорезистивный кантилеверный сенсор был применен [26] для регистрации стафилококкового энтеротоксина Б с концентрацией 1 нмоль с использованием тиомодифицированных аптамеров в качестве рецепторов. Данный токсин может выделяться некоторыми видами стафилококка. Также был детектирован рицин в концентрации 0,14 и 0,28 нмоль. В качестве рецептора использовались меченые биотином поликлональные антитела. Рицин является чрезвычайно ядовитым токсином растительного происхождения.
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ
В КАЧЕСТВЕ БИОСЕНСОРНЫХ УСТРОЙСТВ
Основным измерительным элементом в кантилеверном сенсоре является кремниевый датчик. Технологии микрообработки кремния хорошо изучены благодаря применению в микроэлектронике. Это делает их доступными и недорогими. По данным Yole Development, микрообработка 1 см2 кремния обходится производителям в 0,165 долл. США. На одном квадратном сантиметре кремниевой подложки может свободно уместиться более 10 кантилеверных датчиков. Выполнен ряд работ, нацеленных на разработку экономичных методик производства кантилеверных датчиков [27, 28]. В результате были созданы методики, позволяющие изготавливать кантилеверные сенсоры высокого качества с минимальными затратами.
КОММЕРЧЕСКИ ДОСТУПНЫЕ КОМПОНЕНТЫ И МОДУЛИ ДЛЯ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ
В настоящее время несколько компаний продают коммерческие кантилеверы для разработки сенсорных устройств [29, 30] (рис.4). На рынке также представлены готовые установки для проведения экспериментов по изучению взаимодействий на поверхности кантилеверов, которые могут служить основой для создания сенсора. Большинство элементов биосенсорного устройства, такие как источники лазерного излучения, фотодетекторы, электронные компоненты также коммерчески доступны.
Ниже приведен список основных производителей кантилеверов:
NanoAndMore (www.nanoandmore.com);
Bruker (brukerafmprobes.com);
Olympus (probe.olympus-global.com);
NanoScience Instruments (www.nanoscience.com).
ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ БИОСЕНСОРОВ
НА ОСНОВЕ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ
Одним из основных преимуществ кантилеверных сенсоров является то, что они обеспечивают прямой анализ, не требуя введения дополнительных меток. Это позволяет максимально упростить процедуру пробоподготовки и вести непрерывный мониторинг в режиме реального времени.
Несмотря на то что кантилеверные сенсоры могут напрямую измерять взаимодействие между антителами и антигенами или гибридизацию ДНК, их чувствительность зачастую недостаточна для практического применения [31]. Разработаны способы усиления сигнала, такие как использование наночастиц [24] или создание специального матрикса на поверхности кантилевера [22]. Важным лимитирующим фактором для достижения максимальной чувствительности является неспецифическое связывание. Кантилеверные сенсоры, работающие в статическом режиме, имеют высокую степень защиты от неспецифического связывания, так как энергия неспецифического взаимодействия вносит лишь небольшой вклад в изгиб кантилевера. Сенсоры, работающие в резонансном режиме, напротив реагируют на любую присоединенную массу.
Еще одним минусом является большая подверженность кантилеверов (особенно в статическом режиме) внешнему воздействию, например изменению температуры, флуктуациям потока жидкости, сейсмическим шумам, что ведет к увеличению погрешности измерений. Сенсоры, работающие в резонансном режиме, более устойчивы к подобным факторам, однако в жидкости добротность резонансных изгибных колебаний сильно падает, что также ведет к уменьшению чувствительности. Избежать этого возможно, используя для измерений продольные моды колебаний [32].
АКТУАЛЬНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Кантилеверные биосенсоры являются многообещающей платформой для создания высокочувствительных и селективных сенсорных устройств. При этом существует ряд критических факторов, определяющих развитие данной технологии.
Важнейшим направлением исследований для создания сенсоров на основе микрокантилеверов является поверхностная химия. От качества рецепторного слоя зависят работоспособность и характеристики всего сенсора. Не существует универсальных способов модификации кантилеверов. Для каждого конкретного сенсорного приложения нужно разрабатывать отдельную методику, обеспечивающую наилучшие результаты. Таким образом, разработка протоколов создания рецепторных слоев и их исследование являются ключевыми задачами для успешного создания сенсора.
Другое важнейшее направление – поиск новых материалов. Как было показано, характеристики материала существенно влияют на чувствительность датчика, и, используя новые функциональные материалы, можно добиться существенного увеличения чувствительности системы регистрации. Широкие перспективы открывает применение полимерных материалов. Однако технологии изготовления микроэлектромеханических систем из них отработаны не так хорошо, как для кремния и его соединений.
Конечной целью совершенствования технологий кантилеверных сенсоров должно служить достижение чувствительности, позволяющей детектировать единичную молекулу вещества при сохранении селективности.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 02.G25.31.0135).
ЛИТЕРАТУРА
Ricciardi C., Canavese G., Castagna R., Ferrante I., Ricci A., Marasso S.L., Napione L., Bussolino F. Integration of microfluidic and cantilever technology for biosensing application in liquid environment // Biosens Bioelectron. 2010, Dec. 15; 26(4): 1565-70.
Hagleitner C., Hierlemann A., Lange D., Kummer A., Kerness N., Brand O., Baltes H. Smart single-chip gas sensor microsystem // Nature 414, 293–296.
Chen C.H., Hwang R.Z. et. al. IEEE Trans. Biomed. Eng., 2009, vol. 56, No. 2, pp. 462–470.
Cheney C.P. et al. In vivo wireless ethanol vapor detection in the Wistar rat // Sensors and Actuators B, 138 (2009), p. 264.
Wu G., Datar R.H., Hansen K.M., Thundat T., Cote R.J., Majumdar A. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers // Nat. Biotechnol., 2001, 19, 856–860.
Arntz Y., Seelig J.D., Lang H.P., Zhang J., Hunziker P., Ramseyer J.P., Meyer E., Hegner M., Gerber C. Label-free protein assay based on a nanomechanical cantilever array // Nanotechnology, 14. 2003. 86–90.
Vasan A.S., Mahadeo D.M., Doraiswami R., Huang Y., Pecht M. Point-of-care biosensor system //
Front Biosci (Schol Ed), 2013, 5, 39–71.
Baller M.K., Lang H.P., Fritz J., Gerber Ch., Gimzewski J.K., Drechsler U., Rothuizen H., Despont M., Vettiger P., Battiston F.M. et al. A cantilever array-based artificial nose // Ultramicroscopy 2000, 82, 1–9.
Chen G.Y., Thundat T., Wachter E.A., Warmack R.J.
Adsorption-induced surface stress and its effects on resonance frequency of microcantilevers // J. Appl. Phys., 77. 1995. 3618–22.
Hansen K.M., Ji H.F., Wu G., Datar R., Cote R., Majumdar A., Thundat T. Cantilever-based optical deflection assay for discrimination of DNA single-nucleotide mismatches // Anal. Chem., 73. 2001. 1567–71.
Edberg S.C., Rice E.W., Karlin R.J., Allen M.J. Escherichia coli: the best biological drinking water indicator for public health protection //
J Appl Microbiol 88. 2000. 106S–116S.
Ilic B., Czaplewski D., Zalalutdinov M., Craighead H.G., Neuzil P., Campagnolo C., Batt C. Single cell detection with micromechanical oscillators // J Vac Sci Technol B 19. 2001. 2825–2828.
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M. et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid // Nature 446. 2007. 1066–1069.
Campbell G.A., Mutharasan R. Detection of pathogen Escherichia coli O157:H7 using self-excited PZT-glass microcantilevers // Biosens Bioelectron 21. 2005. 462–473.
Zhang J., Ji H.F. An anti-E.coli O157: H7 antibodyimmobilized microcantilever for the detection of Escherichia coli (E-coli) // Anal Sci 20. 2004. 585–587.
Zhu Q., Shih W.Y., Shih W.H. Real-time, label-free, allelectrical detection of Salmonella typhimurium using lead titanate zirconate/gold-coated glass cantilevers at any relative humidity // Sens Actuators B Chem 125. 2007. 379–388.
Weeks B.L., Camarero J., Noy A., Miller A.E., Stanker L., De Yoreo J.J. A microcantilever-based pathogen detector // Scanning 25. 2003. 297–299.
Campbell G.A., Mutharasan R. Piezoelectric-excited millimeter-sized cantilever (PEMC) sensors detect Bacillus anthracis at 300 spores/mL // Biosens Bioelectron 21. 2006. 1684–1692.
Davila A.P., Jang J., Gupta A.K., Walter T., Aronson A., Bashir R. Microresonator mass sensors for detection of Bacillus anthracis Sterne spores in air and water // Biosens Bioelectron 22. 2007. 3028–3035.
Timurdogan E., Alaca B.E., Kavakli I.H., Urey H. MEMS biosensor for detection of Hepatitis A and C viruses in serum // Biosens Bioelectron, 2011, 28, 189–194.
Gupta A., Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness // Appl Phys Lett. 2004. 84. 1976–1978.
Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors // The Analyst. 2015. 140. 17. pp. 6131–6137.
Hwang K.S., Lee S.M., Eom K., Lee J.H., Lee Y.S., Park J.H., Yoon D.S., Kim T.S. Nanomechanical microcantilever operated in vibration modes with use of RNA aptamer as receptor molecules for label-free detection of HCV helicase // Biosens Bioelectron. 2007 Nov 30. 23(4). 459–65.
Cha B.H., Lee S-M., Park J.C. et al. Detection of Hepatitis B Virus (HBV) DNA at femtomolar concentrations using a silica nanoparticle-enhanced microcantilever sensor // Biosens Bioelectron. 2009. 25. 130–135.
Johnson B.N., Mutharasan R. A cantilever biosensor-based assay for toxin-producing cyanobacteria Microcystis aeruginosa using 16S rRNA //
Environ Sci Technol. 2013. 47(21). 12333–12341.
Rui Zhao, Jianlin Zhang, Jiancheng Yang, Yongzheng Wen, Xiaomei Yu. Multi-target toxin detections based on piezoresistive microcantilevers // 17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. 27–31 October 2013, Freiburg, Germany.
Clausen I., Moe S.T., Vogl A. Design and processing of a cost-effective piezoresistive MEMS cantilever sensor for medical and biomedical use // Journal of Micromechanics and Microengineering. Vol. 22. No 7. 074008.
Faegh S., Jalili N., Yavuzcetin O., Nagesha D., Kumar R., Sridhar S. A cost-effective self-sensing biosensor for detection of biological species at ultralow concentrations // Journal of Applied Physics. 2013. 113. 224905.
http://www.nanoworld.com
http://www.micromotive.de
Sen Xu. Electromechanical biosensors for pathogen detection // Microchim Acta. 2012. 178. 245–260.
Shuh W.Y., Zhu Q., Shih W.-H. Length and thickness dependence of longitudinal flexural resonance frequency shifts of a piezoelectric microcantilever sensor due to Young’s modulus change //
J. Appl. Phys., 2008. 104. 074503.
Bumbu G.G., Wolkenhauer M., Kircher G., Gutmann J.S., Berger R. Micromechanical cantilever technique: a tool for investigating the swelling of polymer brushes // Langmuir, 2007. 23. 4. 2203–2207.
ВАРИАНТЫ ИНТЕГРАЦИИ В СОСТАВ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ
Благодаря своей компактности, кантилеверные сенсоры могут легко встраиваться в состав комплексных биоаналитических устройств. Часто такая интеграция осуществляется в микрофлюидном формате [1]. Микрофлюидный чип позволяет прецизионно управлять маленьким объемом жидкого образца, последовательно обеспечивая стадии пробоподготовки и анализа. Такие комплексные системы называют "система полного микроанализа" или "лаборатория-на-чипе". Кантилеверные сенсоры также могут быть объединены с другими типами сенсоров для проведения более полного анализа. В [2] кантилеверный резонансный сенсор был совмещен с емкостным и калориметрическим датчиками с целью создания газового сенсора для анализа содержащихся в воздухе летучих органических соединений (рис.1). Полная интеграция микроэлектронных и микромеханических компонентов на одном чипе обеспечивает управление и мониторинг функций датчика, а также повышает его общую производительность благодаря усилению сигнала. Схема также включает аналого-цифровые преобразователи и интерфейс передачи данных на внешний модуль записи.
Кантилеверные сенсоры могут интегрироваться со средствами беспроводной передачи данных для создания полностью автономных устройств. Авторы работы [3] разработали и создали кантилеверный сенсор для определения С-реактивного белка с интегрированным беспроводным модулем. Подобные устройства могут быть прототипами имплантируемых сенсоров (рис.2), которые впервые удалось создать относительно недавно [4]. Так как регенерация биосенсора довольно трудна, имплантируемое устройство было использовано для детекции газов крови, например спиртов. Для этого на обратную сторону кантилевера было нанесено гидрофобное покрытие, а золотую сторону модифицировали полимерным тиолированным фторсилоксановым спиртом. Поглощение спирта рецепторным слоем приводит к изгибу кантилевера.
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСЕНСОРОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВАРИАНТА ИНТЕГРАЦИИ
Основным направлением применения биосенсоров является диагностика. Кантилеверные сенсоры позволяют определять белки, являющиеся маркерами различных заболеваний. Например, показана возможность детектирования простат-специфического антигена – маркера заболеваний предстательной железы – на клинически значимом уровне концентраций [5]. В другой работе [6] определялась концентрация миоглобина, являющегося маркером сердечно-сосудистых заболеваний. Многие тесты требуют значительного времени, специально обученного персонала и похода в лабораторию. Компактные и автономные сенсорные устройства на основе микрокантилеверов, интегрированных в микрофлюидные чипы, имеют перспективы для использования в качестве устройств персонализированной диагностики [7]. Время отклика подобных устройств составляет десятки минут. Стационарные приборы могут использоваться в клинических лабораториях в качестве альтернативы или дополнения к стандартным методам диагностики.
Однако диагностика является не единственным применением кантилеверных сенсоров. Основанный на массиве из нескольких кантилеверных датчиков "электронный нос" может применяться для мониторинга окружающей среды. Используя восьмикантилеверный датчик с консолями, покрытыми различными полимерами, авторы [8] показали возможность различать в воздухе "запахи" различных спиртов.
Хотя большинство исследований оперируют данными от одного или нескольких сенсорных кантилеверов, уже показана возможность изготовления тысяч кантилеверов на одном чипе в несколько миллиметров. Компания IBM продемонстрировала размещение 100 кантилеверов на 1 мм2. Таким образом, по плотности упаковки сенсорных элементов кантилеверные датчики приближаются к ДНК-микрочипам. При этом такие чипы не требуют флуоресцентных меток. Основной проблемой остается функционализация такого количества кантилеверов рецепторными молекулами.
ПРИМЕРЫ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БИОМОЛЕКУЛ
За время развития кантилеверных биосенсоров продемонстрировано большое количество приложений по детекции различных видов биомолекул: белков [5, 6], нуклеиновых кислот, углеводов [9]. Была показана возможность зарегистрировать единичный нуклеотидный полиморфизм [10].
Особый интерес представляет разработка сенсоров, чувствительных к биологическим объектам, представляющим опасность для здоровья человека. Патогенные агенты могут быть детектированы с помощью кантилеверных сенсоров как напрямую, так и по анализу их генома, продуктов выделения или токсинов.
Определение наличия целых патогенных клеток часто используется для детекции бактерий. Одним из популярных объектов для отработки метода (в значительной степени благодаря ее наличию в различных образцах еды и воды) является E.coli. Эта бактерия может служить индикатором качества воды [11]. Детектирование отдельной клетки E.coli было продемонстрировано с помощью кантилеверного сенсора в резонансном режиме [12] (рис.3). Однако в данной работе для повышения чувствительности измерения проводились в вакууме и требовалась стадия сушки. Данное ограничение может быть преодолено благодаря применению кантилеверов с внутренним каналом, который может работать в вакууме, при этом анализируя жидкость в канале [13]. В другой работе пьезоэлектрический кантилевер миллиметрового размера был использован для определения E.coli в буферном растворе с пределом обнаружения 700 клеток/мл [14]. Он позволял вести измерения непосредственно в жидкости с получением данных практически в режиме реального времени.
Использование статического режима показало значительно худший предел обнаружения около 106 КОЕ/мл [15]. Видимо связывание таких больших объектов как бактерии не создает на поверхности равномерного поверхностного напряжения. Для бактерии S.Typhimurium кантилевер в резонансном режиме показал предел обнаружения на уровне 5∙103 клеток/мл [16], а в режиме измерения поверхностного напряжения – 106 КОЕ/мл [17]. Кэмпбелл и соавторы использовали кантилевер, модифицированный поликлональными антителами к бактерии B. Anthracis, для измерения в потоке и показали чувствительность в 300 спор/мл [18]. В другом исследовании [19] с использованием кантилеверного сенсора было зарегистрировано 50 спор в воде.
В последние несколько лет популярным стало создание биосенсоров для детектирования вирусов в окружающей среде. Гепатит является одним из самых опасных вирусных заболеваний в мире. Тимурдоган с соавторами [20] использовали кантилеверный биосенсор для определения вирусов гепатита А и С в бычьей сыворотке. Антитела к гепатитам А и С были иммобилизованы на разных кантилеверах, предел обнаружения составил 0,1 нг/мл (1,6 пМ). Гупта в работе [21] показал, что чувствительности кантилевера по измерению массы достаточно, чтобы взвесить отдельный вирус коровьей оспы, однако он не использовал специфичного сенсорного слоя.
В работе [22] было показано детектирование в статическом режиме вируса утиного гриппа А с помощью кантилевера, модифицированного синтетически гликополимером, содержащим остатки сиаловых кислот. Авторы полагают, что слой полимера на поверхности кантилевера создавал матрикс, который усиливал поверхностное натяжение за счет дополнительного взаимодействия с вирусными частицами. Предел обнаружения в данной системе составил 106 вирионов/мл.
Пьезоэлектрический кантилеверный сенсор, работающий в резонансном режиме, был использован для детектирования хеликазы вируса гепатита С с концентрацией 100 пг/мл [23]. Хеликаза является ферментом, отвечающим за развертывание вирусной РНК и специфична для данного вируса. В качестве рецептора были использованы РНК аптамеры – короткие последовательности нуклеотидов, способные специфически связывать антиген (белок). Их можно легко синтезировать, и они более стабильны при хранении, чем антитела.
Другим вариантом детектирования патогенных агентов является определение наличия их нуклеиновых кислот в образце. В отличие от крупных объектов, ДНК и РНК не обладают значительной массой, но было показано, что связывание нуклеиновых кислот с комплиментарными молекулами на поверхности кантилевера вызывает значительное поверхностное напряжение. Было продемонстрировано детектирование неамплифицированной матричной РНК в общей массе РНК клетки с пределом обнаружения 10 пмоль. С использованием микрокантилеверного сенсора и усиления с помощью кремниевых наночастиц удалось достичь определения ДНК вируса гепатита В на фемтомолярном уровне [24]. Фрагмент ДНК вируса длиной 243 нуклеотида был детектирован с помощью зонда на уровне пикомолей. Дальнейшее увеличение чувствительности до фемтомолей было получено за счет гибридизации со вторым зондом, содержащим наночастицу.
В работе [25] описано детектирование производящей токсины цианобактерии M. aeruginosa по видоспецифичному участку гена 16S рибосомальной РНК на уровне концентрации 50 клеток/мл. Для этого на кантилевере были иммобилизованы ДНК олигонуклеотиды, содержащие 27 оснований, комплиментарные к искомому участку генома. Сенсор фиксировал сдвиг резонансной частоты кантилевера, вызванный гибридизацией молекул комплиментарных ДНК, пропорциональный концентрации бактерий в растворе. Достоверность гибридизации была подтверждена флуоресцентными измерениями и вторичной гибридизацией ДНК-зондов с пришитой наночастицей золота.
Пьезорезистивный кантилеверный сенсор был применен [26] для регистрации стафилококкового энтеротоксина Б с концентрацией 1 нмоль с использованием тиомодифицированных аптамеров в качестве рецепторов. Данный токсин может выделяться некоторыми видами стафилококка. Также был детектирован рицин в концентрации 0,14 и 0,28 нмоль. В качестве рецептора использовались меченые биотином поликлональные антитела. Рицин является чрезвычайно ядовитым токсином растительного происхождения.
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ
В КАЧЕСТВЕ БИОСЕНСОРНЫХ УСТРОЙСТВ
Основным измерительным элементом в кантилеверном сенсоре является кремниевый датчик. Технологии микрообработки кремния хорошо изучены благодаря применению в микроэлектронике. Это делает их доступными и недорогими. По данным Yole Development, микрообработка 1 см2 кремния обходится производителям в 0,165 долл. США. На одном квадратном сантиметре кремниевой подложки может свободно уместиться более 10 кантилеверных датчиков. Выполнен ряд работ, нацеленных на разработку экономичных методик производства кантилеверных датчиков [27, 28]. В результате были созданы методики, позволяющие изготавливать кантилеверные сенсоры высокого качества с минимальными затратами.
КОММЕРЧЕСКИ ДОСТУПНЫЕ КОМПОНЕНТЫ И МОДУЛИ ДЛЯ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ
В настоящее время несколько компаний продают коммерческие кантилеверы для разработки сенсорных устройств [29, 30] (рис.4). На рынке также представлены готовые установки для проведения экспериментов по изучению взаимодействий на поверхности кантилеверов, которые могут служить основой для создания сенсора. Большинство элементов биосенсорного устройства, такие как источники лазерного излучения, фотодетекторы, электронные компоненты также коммерчески доступны.
Ниже приведен список основных производителей кантилеверов:
NanoAndMore (www.nanoandmore.com);
Bruker (brukerafmprobes.com);
Olympus (probe.olympus-global.com);
NanoScience Instruments (www.nanoscience.com).
ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ БИОСЕНСОРОВ
НА ОСНОВЕ МИКРОКАНТИЛЕВЕРОВ
Одним из основных преимуществ кантилеверных сенсоров является то, что они обеспечивают прямой анализ, не требуя введения дополнительных меток. Это позволяет максимально упростить процедуру пробоподготовки и вести непрерывный мониторинг в режиме реального времени.
Несмотря на то что кантилеверные сенсоры могут напрямую измерять взаимодействие между антителами и антигенами или гибридизацию ДНК, их чувствительность зачастую недостаточна для практического применения [31]. Разработаны способы усиления сигнала, такие как использование наночастиц [24] или создание специального матрикса на поверхности кантилевера [22]. Важным лимитирующим фактором для достижения максимальной чувствительности является неспецифическое связывание. Кантилеверные сенсоры, работающие в статическом режиме, имеют высокую степень защиты от неспецифического связывания, так как энергия неспецифического взаимодействия вносит лишь небольшой вклад в изгиб кантилевера. Сенсоры, работающие в резонансном режиме, напротив реагируют на любую присоединенную массу.
Еще одним минусом является большая подверженность кантилеверов (особенно в статическом режиме) внешнему воздействию, например изменению температуры, флуктуациям потока жидкости, сейсмическим шумам, что ведет к увеличению погрешности измерений. Сенсоры, работающие в резонансном режиме, более устойчивы к подобным факторам, однако в жидкости добротность резонансных изгибных колебаний сильно падает, что также ведет к уменьшению чувствительности. Избежать этого возможно, используя для измерений продольные моды колебаний [32].
АКТУАЛЬНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Кантилеверные биосенсоры являются многообещающей платформой для создания высокочувствительных и селективных сенсорных устройств. При этом существует ряд критических факторов, определяющих развитие данной технологии.
Важнейшим направлением исследований для создания сенсоров на основе микрокантилеверов является поверхностная химия. От качества рецепторного слоя зависят работоспособность и характеристики всего сенсора. Не существует универсальных способов модификации кантилеверов. Для каждого конкретного сенсорного приложения нужно разрабатывать отдельную методику, обеспечивающую наилучшие результаты. Таким образом, разработка протоколов создания рецепторных слоев и их исследование являются ключевыми задачами для успешного создания сенсора.
Другое важнейшее направление – поиск новых материалов. Как было показано, характеристики материала существенно влияют на чувствительность датчика, и, используя новые функциональные материалы, можно добиться существенного увеличения чувствительности системы регистрации. Широкие перспективы открывает применение полимерных материалов. Однако технологии изготовления микроэлектромеханических систем из них отработаны не так хорошо, как для кремния и его соединений.
Конечной целью совершенствования технологий кантилеверных сенсоров должно служить достижение чувствительности, позволяющей детектировать единичную молекулу вещества при сохранении селективности.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 02.G25.31.0135).
ЛИТЕРАТУРА
Ricciardi C., Canavese G., Castagna R., Ferrante I., Ricci A., Marasso S.L., Napione L., Bussolino F. Integration of microfluidic and cantilever technology for biosensing application in liquid environment // Biosens Bioelectron. 2010, Dec. 15; 26(4): 1565-70.
Hagleitner C., Hierlemann A., Lange D., Kummer A., Kerness N., Brand O., Baltes H. Smart single-chip gas sensor microsystem // Nature 414, 293–296.
Chen C.H., Hwang R.Z. et. al. IEEE Trans. Biomed. Eng., 2009, vol. 56, No. 2, pp. 462–470.
Cheney C.P. et al. In vivo wireless ethanol vapor detection in the Wistar rat // Sensors and Actuators B, 138 (2009), p. 264.
Wu G., Datar R.H., Hansen K.M., Thundat T., Cote R.J., Majumdar A. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers // Nat. Biotechnol., 2001, 19, 856–860.
Arntz Y., Seelig J.D., Lang H.P., Zhang J., Hunziker P., Ramseyer J.P., Meyer E., Hegner M., Gerber C. Label-free protein assay based on a nanomechanical cantilever array // Nanotechnology, 14. 2003. 86–90.
Vasan A.S., Mahadeo D.M., Doraiswami R., Huang Y., Pecht M. Point-of-care biosensor system //
Front Biosci (Schol Ed), 2013, 5, 39–71.
Baller M.K., Lang H.P., Fritz J., Gerber Ch., Gimzewski J.K., Drechsler U., Rothuizen H., Despont M., Vettiger P., Battiston F.M. et al. A cantilever array-based artificial nose // Ultramicroscopy 2000, 82, 1–9.
Chen G.Y., Thundat T., Wachter E.A., Warmack R.J.
Adsorption-induced surface stress and its effects on resonance frequency of microcantilevers // J. Appl. Phys., 77. 1995. 3618–22.
Hansen K.M., Ji H.F., Wu G., Datar R., Cote R., Majumdar A., Thundat T. Cantilever-based optical deflection assay for discrimination of DNA single-nucleotide mismatches // Anal. Chem., 73. 2001. 1567–71.
Edberg S.C., Rice E.W., Karlin R.J., Allen M.J. Escherichia coli: the best biological drinking water indicator for public health protection //
J Appl Microbiol 88. 2000. 106S–116S.
Ilic B., Czaplewski D., Zalalutdinov M., Craighead H.G., Neuzil P., Campagnolo C., Batt C. Single cell detection with micromechanical oscillators // J Vac Sci Technol B 19. 2001. 2825–2828.
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M. et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid // Nature 446. 2007. 1066–1069.
Campbell G.A., Mutharasan R. Detection of pathogen Escherichia coli O157:H7 using self-excited PZT-glass microcantilevers // Biosens Bioelectron 21. 2005. 462–473.
Zhang J., Ji H.F. An anti-E.coli O157: H7 antibodyimmobilized microcantilever for the detection of Escherichia coli (E-coli) // Anal Sci 20. 2004. 585–587.
Zhu Q., Shih W.Y., Shih W.H. Real-time, label-free, allelectrical detection of Salmonella typhimurium using lead titanate zirconate/gold-coated glass cantilevers at any relative humidity // Sens Actuators B Chem 125. 2007. 379–388.
Weeks B.L., Camarero J., Noy A., Miller A.E., Stanker L., De Yoreo J.J. A microcantilever-based pathogen detector // Scanning 25. 2003. 297–299.
Campbell G.A., Mutharasan R. Piezoelectric-excited millimeter-sized cantilever (PEMC) sensors detect Bacillus anthracis at 300 spores/mL // Biosens Bioelectron 21. 2006. 1684–1692.
Davila A.P., Jang J., Gupta A.K., Walter T., Aronson A., Bashir R. Microresonator mass sensors for detection of Bacillus anthracis Sterne spores in air and water // Biosens Bioelectron 22. 2007. 3028–3035.
Timurdogan E., Alaca B.E., Kavakli I.H., Urey H. MEMS biosensor for detection of Hepatitis A and C viruses in serum // Biosens Bioelectron, 2011, 28, 189–194.
Gupta A., Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness // Appl Phys Lett. 2004. 84. 1976–1978.
Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors // The Analyst. 2015. 140. 17. pp. 6131–6137.
Hwang K.S., Lee S.M., Eom K., Lee J.H., Lee Y.S., Park J.H., Yoon D.S., Kim T.S. Nanomechanical microcantilever operated in vibration modes with use of RNA aptamer as receptor molecules for label-free detection of HCV helicase // Biosens Bioelectron. 2007 Nov 30. 23(4). 459–65.
Cha B.H., Lee S-M., Park J.C. et al. Detection of Hepatitis B Virus (HBV) DNA at femtomolar concentrations using a silica nanoparticle-enhanced microcantilever sensor // Biosens Bioelectron. 2009. 25. 130–135.
Johnson B.N., Mutharasan R. A cantilever biosensor-based assay for toxin-producing cyanobacteria Microcystis aeruginosa using 16S rRNA //
Environ Sci Technol. 2013. 47(21). 12333–12341.
Rui Zhao, Jianlin Zhang, Jiancheng Yang, Yongzheng Wen, Xiaomei Yu. Multi-target toxin detections based on piezoresistive microcantilevers // 17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. 27–31 October 2013, Freiburg, Germany.
Clausen I., Moe S.T., Vogl A. Design and processing of a cost-effective piezoresistive MEMS cantilever sensor for medical and biomedical use // Journal of Micromechanics and Microengineering. Vol. 22. No 7. 074008.
Faegh S., Jalili N., Yavuzcetin O., Nagesha D., Kumar R., Sridhar S. A cost-effective self-sensing biosensor for detection of biological species at ultralow concentrations // Journal of Applied Physics. 2013. 113. 224905.
http://www.nanoworld.com
http://www.micromotive.de
Sen Xu. Electromechanical biosensors for pathogen detection // Microchim Acta. 2012. 178. 245–260.
Shuh W.Y., Zhu Q., Shih W.-H. Length and thickness dependence of longitudinal flexural resonance frequency shifts of a piezoelectric microcantilever sensor due to Young’s modulus change //
J. Appl. Phys., 2008. 104. 074503.
Bumbu G.G., Wolkenhauer M., Kircher G., Gutmann J.S., Berger R. Micromechanical cantilever technique: a tool for investigating the swelling of polymer brushes // Langmuir, 2007. 23. 4. 2203–2207.
Отзывы читателей
