eng
Выпуск #8/2016
А.Ахметова, Н.Гутник, Г.Мешков, И.Назаров, О.Синицына, И.Яминский
Биосенсор для обнаружения вирусов и бактерий в жидкостях
Биосенсор для обнаружения вирусов и бактерий в жидкостях
Просмотры: 5444
Приведено описание разработки компактного и недорогого биосенсора, предназначенного для использования в медицинской диагностике.
DOI:10.22184/1993-8578.2016.70.8.68.73
DOI:10.22184/1993-8578.2016.70.8.68.73
Теги: biochip flow-through liquid cell scanning probe microscopy биочип проточная жидкостная ячейка сканирующий зондовый микроскоп
Блок-схема биосенсора приведена на рис.1. Биочип представляет собой миниатюрный пьезокерамический диск с сенсорными слоями на противоположных сторонах. При присоединении биологического агента к сенсорной поверхности биочипа происходит изменение резонансной частоты механических колебаний диска.
В результате взаимодействия патогенов с рецепторным слоем эффективная масса и жесткость биочипа будут изменяться, что может быть зарегистрировано по сдвигу резонансной частоты кантилевера:
, (1)
где Δf, Δk, Δm – изменения резонансной частоты, жесткости и массы биочипа, а fn, k и m – первоначальные значения этих параметров.
Рассмотрим случай обнаружения бактериальной клетки Escherichia coli. Длина бактерий составляет 2–6 мкм, а диаметр – около 1 мкм. При средней длине в 4 мкм масса бактерии равна около 3,1 · 10–12 г. Биочип диаметром 3 мм и толщиной 0,1 мм из пьезокерамики ЦТС-19 имеет объем 0,7 · 10–3 см3, а его масса при плотности материала 7,5 г/см3 составляет 5,3 · 10–3 г. Прикрепление одной бактериальной клетки приводит к относительному изменению резонансной частоты на величину:
. (2)
Согласно соотношению (2), относительная стабильность частоты генератора возбуждающих колебаний должна быть на уровне 10–10.
Общий вид проточной ячейки с размещенным в ней пьезокерамическим биочипом представлен на рис.2. Для циркуляции жидкости, содержащей детектируемые патогены, используются перистальтический насос и соединительные трубки. Проточная жидкостная ячейка и соединительные трубки составляют герметичную камеру с циркулирующей биологической жидкостью. Соединительные трубки и проточная жидкостная ячейка выполнены из недорогих инертных материалов (силиконовой резины и полиэтилена соответственно) и могут быть расходными элементами одноразового использования.
Погрешность измерения частоты пьезоэлектрического биочипа Δf, обусловленная электронными шумами измерительной схемы, нестабильностью пьезокерамики и другими возможными факторами, ограничивает чувствительность метода. Для оценки уровня собственных шумов измерительной схемы биосенсора использовался пьезокерамический резонатор ZTB с резонансной частотой 1 МГц.
Определение резонансной частоты колебаний биочипа проводилось следующим образом.
С помощью цифрового синтезатора частоты с использованием микросхемы AD7008 (Analog Devices) и прецизионного усилителя входного сигнала осуществлялась запись амплитудно-частотной характеристики пьезокерамического резонатора (рис.3). При построении амплитудно-частотной характеристики проводилось 512 измерений в выбранном диапазоне частот. Для повышения точности можно последовательно снимать несколько характеристик. Резонансная частота вычислялась по методу определения "центра масс":
.
Такой метод дает существенно большую точность при наличии реальных шумов, чем простой поиск максимума на кривой.
На рис.4 представлены данные обработки 512 резонансных кривых, каждая из которых была построена по 512 точкам. Соответственно, общее число проведенных отсчетов (отдельных измерений) – 262 144.
Среднеквадратичная погрешность в определении резонансной частоты биочипа при использовании линейного усреднения по пяти последовательным измерениям составила 1,8 Гц, что соответствует среднеквадратичному отклонению экспериментальной кривой (черная линия) на рис.4 от среднего значения. В нашем случае погрешность определения массы биочипа, рассчитанная по формуле 2, составляет Δm = 6 · 10–10 г, что примерно соответствует массе двухсот бактерий E.coli.
В блоке управления биосенсора используются электронные платы цифрового синтезатора частот, прецизионного усилителя входного сигнала, интерфейса для связи с компьютерным блоком, термостата проточной жидкостной ячейки, ЦАП-АЦП, стабилизированного питания. На рис.5 приведены основные платы макета биосенсора и его корпус.
Существенным фактором является симметричность конструкции биосенсора. Пластинка биочипа обладает геометрической симметрией, однако электрическая схема подачи напряжения несимметрична, поскольку на противоположные стороны подаются напряжения различной полярности. Вследствие этого структура приповерхностного двойного электропроводящего слоя вблизи противоположных сторон биочипа существенно различна, что может влиять как на рецепторный слой, так и на свойства адсорбируемой пленки из биологических агентов. Для достижения полной симметрии электрической схемы предложено оригинальное решение [5] с использованием составного пьезокерамического биочипа (рис.6).
В биочипе указанной конструкции электрическое напряжение можно подавать только на внутренние электроды, а наружные электроды заземляются или имеют потенциал раствора. В этом случае достигается симметрия в геометрии биочипа, в подаче электрических напряжений, и, как следствие, полная симметрия двойных приповерхностных электропроводящих слоев.
Проведенные расчеты и оценки показывают, что технические параметры цифрового синтезатора частот (точность задания частоты 0,001 Гц за счет использования 32-битового управления) позволяют достичь чувствительности, необходимой для регистрации с помощью прецизионного усилителя входного сигнала при следующих минимальных концентрациях биологических агентов:
• для вирусов гриппа А в жидкости – 104 вирусов / мл;
• для бактерий E.coli в жидкости – 102 бактерий / мл.
Для дальнейшего увеличения чувствительности биосенсора до уровня единичных патогенов необходимо использовать биочипы существенно меньших размеров – с толщиной и диаметром микронных размеров. Изготовление такого биочипа является технологически сложным, но при наличии соответствующей производственной базы реализуемым процессом.
НИОКТР выполняется в МГУ им. М.В.Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 02.G25.31.0135).
ЛИТЕРАТУРА
1. Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V. Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors // Analyst. 2015. 140. 6131–6137.
2. Колесов Д., Яминский И., Ахметова А., Синицына О., Мешков Г. Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий // Наноиндустрия. 2016. № 5 (67).
C. 26–34.
3. Колесов Д., Яминский И., Ахметова А., Синицына О., Мешков Г. Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий // Наноиндустрия. 2016. № 4 (67). C. 26–35.
4. Киселев Г., Горелкин П., Ерофеев А., Колесов Д., Яминский И. Детекция вирусов с помощью пьезоэлектрических кантилеверов // Наноиндустрия. 2015. № 4 (58). C. 62–67.
5. Ахметова А.И., Мешков Г.Б., Назаров И.А., Сагитова А.В., Яминский И.В. Биосенсорное устройство для обнаружения биологических микро- и нанообъектов. Заявка на патент на изобретение. Заявка № 2016141844 от 25.10.2016.
В результате взаимодействия патогенов с рецепторным слоем эффективная масса и жесткость биочипа будут изменяться, что может быть зарегистрировано по сдвигу резонансной частоты кантилевера:
, (1)
где Δf, Δk, Δm – изменения резонансной частоты, жесткости и массы биочипа, а fn, k и m – первоначальные значения этих параметров.
Рассмотрим случай обнаружения бактериальной клетки Escherichia coli. Длина бактерий составляет 2–6 мкм, а диаметр – около 1 мкм. При средней длине в 4 мкм масса бактерии равна около 3,1 · 10–12 г. Биочип диаметром 3 мм и толщиной 0,1 мм из пьезокерамики ЦТС-19 имеет объем 0,7 · 10–3 см3, а его масса при плотности материала 7,5 г/см3 составляет 5,3 · 10–3 г. Прикрепление одной бактериальной клетки приводит к относительному изменению резонансной частоты на величину:
. (2)
Согласно соотношению (2), относительная стабильность частоты генератора возбуждающих колебаний должна быть на уровне 10–10.
Общий вид проточной ячейки с размещенным в ней пьезокерамическим биочипом представлен на рис.2. Для циркуляции жидкости, содержащей детектируемые патогены, используются перистальтический насос и соединительные трубки. Проточная жидкостная ячейка и соединительные трубки составляют герметичную камеру с циркулирующей биологической жидкостью. Соединительные трубки и проточная жидкостная ячейка выполнены из недорогих инертных материалов (силиконовой резины и полиэтилена соответственно) и могут быть расходными элементами одноразового использования.
Погрешность измерения частоты пьезоэлектрического биочипа Δf, обусловленная электронными шумами измерительной схемы, нестабильностью пьезокерамики и другими возможными факторами, ограничивает чувствительность метода. Для оценки уровня собственных шумов измерительной схемы биосенсора использовался пьезокерамический резонатор ZTB с резонансной частотой 1 МГц.
Определение резонансной частоты колебаний биочипа проводилось следующим образом.
С помощью цифрового синтезатора частоты с использованием микросхемы AD7008 (Analog Devices) и прецизионного усилителя входного сигнала осуществлялась запись амплитудно-частотной характеристики пьезокерамического резонатора (рис.3). При построении амплитудно-частотной характеристики проводилось 512 измерений в выбранном диапазоне частот. Для повышения точности можно последовательно снимать несколько характеристик. Резонансная частота вычислялась по методу определения "центра масс":
.
Такой метод дает существенно большую точность при наличии реальных шумов, чем простой поиск максимума на кривой.
На рис.4 представлены данные обработки 512 резонансных кривых, каждая из которых была построена по 512 точкам. Соответственно, общее число проведенных отсчетов (отдельных измерений) – 262 144.
Среднеквадратичная погрешность в определении резонансной частоты биочипа при использовании линейного усреднения по пяти последовательным измерениям составила 1,8 Гц, что соответствует среднеквадратичному отклонению экспериментальной кривой (черная линия) на рис.4 от среднего значения. В нашем случае погрешность определения массы биочипа, рассчитанная по формуле 2, составляет Δm = 6 · 10–10 г, что примерно соответствует массе двухсот бактерий E.coli.
В блоке управления биосенсора используются электронные платы цифрового синтезатора частот, прецизионного усилителя входного сигнала, интерфейса для связи с компьютерным блоком, термостата проточной жидкостной ячейки, ЦАП-АЦП, стабилизированного питания. На рис.5 приведены основные платы макета биосенсора и его корпус.
Существенным фактором является симметричность конструкции биосенсора. Пластинка биочипа обладает геометрической симметрией, однако электрическая схема подачи напряжения несимметрична, поскольку на противоположные стороны подаются напряжения различной полярности. Вследствие этого структура приповерхностного двойного электропроводящего слоя вблизи противоположных сторон биочипа существенно различна, что может влиять как на рецепторный слой, так и на свойства адсорбируемой пленки из биологических агентов. Для достижения полной симметрии электрической схемы предложено оригинальное решение [5] с использованием составного пьезокерамического биочипа (рис.6).
В биочипе указанной конструкции электрическое напряжение можно подавать только на внутренние электроды, а наружные электроды заземляются или имеют потенциал раствора. В этом случае достигается симметрия в геометрии биочипа, в подаче электрических напряжений, и, как следствие, полная симметрия двойных приповерхностных электропроводящих слоев.
Проведенные расчеты и оценки показывают, что технические параметры цифрового синтезатора частот (точность задания частоты 0,001 Гц за счет использования 32-битового управления) позволяют достичь чувствительности, необходимой для регистрации с помощью прецизионного усилителя входного сигнала при следующих минимальных концентрациях биологических агентов:
• для вирусов гриппа А в жидкости – 104 вирусов / мл;
• для бактерий E.coli в жидкости – 102 бактерий / мл.
Для дальнейшего увеличения чувствительности биосенсора до уровня единичных патогенов необходимо использовать биочипы существенно меньших размеров – с толщиной и диаметром микронных размеров. Изготовление такого биочипа является технологически сложным, но при наличии соответствующей производственной базы реализуемым процессом.
НИОКТР выполняется в МГУ им. М.В.Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 02.G25.31.0135).
ЛИТЕРАТУРА
1. Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V. Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors // Analyst. 2015. 140. 6131–6137.
2. Колесов Д., Яминский И., Ахметова А., Синицына О., Мешков Г. Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий // Наноиндустрия. 2016. № 5 (67).
C. 26–34.
3. Колесов Д., Яминский И., Ахметова А., Синицына О., Мешков Г. Кантилеверные биосенсоры для обнаружения вирусов и бактерий // Наноиндустрия. 2016. № 4 (67). C. 26–35.
4. Киселев Г., Горелкин П., Ерофеев А., Колесов Д., Яминский И. Детекция вирусов с помощью пьезоэлектрических кантилеверов // Наноиндустрия. 2015. № 4 (58). C. 62–67.
5. Ахметова А.И., Мешков Г.Б., Назаров И.А., Сагитова А.В., Яминский И.В. Биосенсорное устройство для обнаружения биологических микро- и нанообъектов. Заявка на патент на изобретение. Заявка № 2016141844 от 25.10.2016.
Отзывы читателей
