eng
Выпуск #2/2017
М.Зубашева, А.Сагитова, Ю.Смирнов, Т.Смирнова, Р.Азизбекян, В.Жуховицкий, И.Яминский
Ультраструктурный анализ Brevibacillus laterosporus методами электронной и атомно-силовой микроскопии
Ультраструктурный анализ Brevibacillus laterosporus методами электронной и атомно-силовой микроскопии
Просмотры: 4424
Представлены экспериментальные данные электронной и атомно-силовой микроскопии спор Brevibacillus laterosporus. Определены размер и строение спор и входящих в их состав каноэвидных включений. Штаммы Brevibacillus laterosporus, обладающие инсектицидными свойствами, могут применяться для борьбы с переносчиками заболеваний, передаваемых через укусы насекомых.
УДК 578.2, ВАК 05.11.13, DOI: 10.22184/1993-8578.2017.72.2.74.78
УДК 578.2, ВАК 05.11.13, DOI: 10.22184/1993-8578.2017.72.2.74.78
Теги: atomic force microscopy bacterial spores crystals disputes electron microscopy insecticide scanning probe microscopy атомно-силовая микроскопия инсектицид кристаллы сканирующая зондовая микроскопия споры электронная микроскопия
Brevibacillus laterosporus (B. laterosporus) относится к бациллам с инсектицидными свойствами. Особый интерес представляют штаммы B. laterosporus, образующие москитоцидные кристаллы [1, 2]. Известно, что для этого вида бацилл характерны уникальные каноэвидные включения, прикрепленные к споре [3]. Ранее авторами были исследованы различные кристаллоносные штаммы B. laterosporus методами просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии [1, 4, 5, 6].
В отличие от некоторых других бацилл, в том числе энтомопатогенных, споры B. laterosporus лишены экзоспориума. Методом СЭМ было показано, что такие споры имеют складчатую неровную поверхность. При этом, структура спор B. laterosporus штаммоспецифична. Так, у B. laterosporus 16-92 спора окружена фибриллярной капсулой, которая отсутствует у других штаммов. Каноэвидное включение имеет у разных штаммов неодинаковый размер и структуру. Кристаллы, продуцируемые B. Laterosporus, различаются по форме, размерам и биологической активности [5].
Несмотря на интенсивное электронно-микроскопическое изучение морфологии этого вида бацилл, детали ультраструктуры спор и кристаллов исследованы недостаточно из-за невозможности работы с нативным материалом. Как известно, техника пробоподготовки материала в электронной микроскопии включает фиксацию, окрашивание, обезвоживание, заливку в смолу. Эти методы нарушают структурную целостность биологических объектов и не позволяют точно определить их размеры. Альтернативным высокоразрешающим методом изучения нативной ультраструктуры образцов, в том числе бактериальных спор, является атомно-силовая микроскопия, которая позволяет визуализировать архитектуру спор на молекулярном уровне per se, без химического и физического воздействий.
В связи с этим представляет интерес сравнительное исследование спор и кристаллов методами электронной и атомно-силовой микроскопии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы B. laterosporus были получены из лабораторной коллекции ВНИИ Генетика (16-92) и коллекции Института Пастера (Париж) от д-ра Люкаде (Lat 006). Штаммы выращивали на агаризованной среде NBY в течение 72 ч при 30 ⁰С. Споры и кристаллы для исследований смывали с агара, суспендировали и промывали в дистиллированной воде.
Электронная микроскопия проводилась методами негативного контрастирования и ультратонких срезов, как описано в [7]. К негативному контрастированию суспензию спор и кристаллов готовили двумя способами. В первом случае суспензию наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, укрепленной углеродом, и окрашивали 1%-ным водным раствором уранил ацетата. Во втором случае суспензию наносили на сетки, покрытые углеродной пленкой и окрашивали 2%-ным водным раствором NANOW. Применялись электронные микроскопы JEM-100 B и LEO912AB.
Для атомно-силовой микроскопии был использован многофункциональный СЗМ "ФемтоCкан" [8] и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Тонкая структура спор и кристаллов были изучены ранее методом ультратонких срезов [1, 2]. На рис.1а и 1b представлены споры в спорангии и свободные споры. В спорангии, помимо споры, присутствует ромбовидный кристалл. Споры связаны со слоистым каноэ, окружены споровой оболочкой и кортексом. Каноэ примыкает к споре с одной стороны. На противоположной стороне споры видна только складчатая споровая оболочка. На представленных микрофотографиях видно, что у штамма 16-92 каноэ узкое, с плотно уложенными слоями.
Ультраструктура штамма B. laterosporus Lat 006 имеет свои особенности. В спорангии рядом со спорой наблюдается кубический кристалл (рис.1c). У зрелых спор штамма Lat 006 обнаружено крупное рыхлое каноэ (рис.1d). Слои каноэ, видимо из-за отсутствия ригидности, располагаются волнообразно. У Lat 006 обнаружены пластинчатые, квадратные кристаллы со сглаженными углами. При лизисе спорангия споры вместе с каноэвидным включением и кристаллы освобождаются раздельно.
На рис.2 представлены изображения электронно-плотных овальных спор B. laterosporus 16-92 с каноэвидным включением.
При использовании контрастирования с помощью NANOW на поверхности спор штамма 16-92 удается наблюдать многочисленные длинные тонкие выросты (рис.3), которые отсутствуют у штамма Lat 006 (рис.4). На рис.4 хорошо видно крупное каноэ, в которое погружена собственно спора Lat 006. На этом изображении также видны квадратные электронно-плотные кристаллы.
Споры и кристаллы B. laterosporus исследованы меньше, чем другие энтомопатогенные бактерии. В особенности это касается каноэ, функция которого не определена, и кристаллов, чья активность по отношению к различным биологическим объектам слабо изучена.
Трехмерное изображение споры B. laterosporus, нанесенной на поверхность свежесколотой слюды, получено с помощью сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан" (Центр перспективных технологий, РФ). Споры B. laterosporus исследованы с помощью метода атомно-силовой микроскопии (рис.5). Наблюдаемый размер споры составил около 1,5 мкм. Построение изображения выполнено в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" [9].
Атомно-силовая микроскопия позволяет получить данные о трехмерном рельефе, оценить объем споры при ее высушивании на воздухе.
Штаммы B. laterosporus специфически активны по отношению к личинкам различных двухкрылых насекомых, в частности, против комаров An. stephensi и Ae. Аegypti. Высокий биоцидный эффект (антибактериальный, фунгицидный, цианолитический) позволяет использовать эти штаммы в качестве продуцентов биологических средств защиты растений от болезней и для борьбы с токсическими микроскопическими водорослями (сине-зелеными бактериями).
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта 15-04-07678.
ЛИТЕРАТУРА
1. Smirnova T.D., Minenkova I., Orlova M.V., Azizbekyan R.R., Lecadet M. The crystal-forming strains of bacillus laterosporus // Research in Microbiology. 1996. Т. 147. № 5. С. 343–350.
2. Orlova M.V., Smirnova T.A., Azizbekyan R.R., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y. Insecticidal activity of bacillus laterosporus // Applied and Environmental Microbiology. 1998. Т. 64. № 7. С. 2723–2725.
3. Fiz-James P.C., Young I.E. Morphological and chemimical studes of the spores and parasporal bodies of Bacillus laterosporus // J. Biochem. Cytol. 1958. 4, С. 639–649.
4. Zubasheva M.V., Smirnova T.A., Azizbekyan R.R., Ganushkina L.A. Larvicidal activity of crystal-forming strains of brevibacillus laterosporus // Applied Biochemistry and Microbiology. 2010. Т. 46. № 8. С. 755–762.
5. Смирнова Т.А., Шевлягина Н.В., Николаенко М.А., Сорокин В.В., Зубашева М.В., Азизбекян Р.Р. Характеристика спор и кристаллов brevibacillus laterosporus // Биотехнология. 2011. № 6. С. 29–37.
6. Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Константинова Г.Е., Ганушкина Л.А., Кузнецова Н.И., Миненкова И.Б., Николаенко М.А., Азизбекян Р.Р. Штамм bacillus laterosporus с множественной биологической активностью // Биотехнология. 1993. № 9. С. 11–15.
7. Смирнова Т.А., Зубашева М.В., Шевлягина Н.В., Николаенко М.А., Азизбекян Р.Р. Электронно-микроскопическое исследование поверхности спор бацилл // Микробиология. 2013. Т. 82. № 6. С. 698–674.
8. Яминский И. Сканирующий зондовый микроскоп ФемтоСкан: новый инструмент для медицины // НАНОИНДУСТРИЯ. 2013. № 5(43). C. 44–46.
9. Yaminsky Y., Filonov A., Sinitsyna O., Meshkov G. FemtoScan Online software // NANOINDUSTRY. 2016. N 2(64). P. 42–46.
В отличие от некоторых других бацилл, в том числе энтомопатогенных, споры B. laterosporus лишены экзоспориума. Методом СЭМ было показано, что такие споры имеют складчатую неровную поверхность. При этом, структура спор B. laterosporus штаммоспецифична. Так, у B. laterosporus 16-92 спора окружена фибриллярной капсулой, которая отсутствует у других штаммов. Каноэвидное включение имеет у разных штаммов неодинаковый размер и структуру. Кристаллы, продуцируемые B. Laterosporus, различаются по форме, размерам и биологической активности [5].
Несмотря на интенсивное электронно-микроскопическое изучение морфологии этого вида бацилл, детали ультраструктуры спор и кристаллов исследованы недостаточно из-за невозможности работы с нативным материалом. Как известно, техника пробоподготовки материала в электронной микроскопии включает фиксацию, окрашивание, обезвоживание, заливку в смолу. Эти методы нарушают структурную целостность биологических объектов и не позволяют точно определить их размеры. Альтернативным высокоразрешающим методом изучения нативной ультраструктуры образцов, в том числе бактериальных спор, является атомно-силовая микроскопия, которая позволяет визуализировать архитектуру спор на молекулярном уровне per se, без химического и физического воздействий.
В связи с этим представляет интерес сравнительное исследование спор и кристаллов методами электронной и атомно-силовой микроскопии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы B. laterosporus были получены из лабораторной коллекции ВНИИ Генетика (16-92) и коллекции Института Пастера (Париж) от д-ра Люкаде (Lat 006). Штаммы выращивали на агаризованной среде NBY в течение 72 ч при 30 ⁰С. Споры и кристаллы для исследований смывали с агара, суспендировали и промывали в дистиллированной воде.
Электронная микроскопия проводилась методами негативного контрастирования и ультратонких срезов, как описано в [7]. К негативному контрастированию суспензию спор и кристаллов готовили двумя способами. В первом случае суспензию наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, укрепленной углеродом, и окрашивали 1%-ным водным раствором уранил ацетата. Во втором случае суспензию наносили на сетки, покрытые углеродной пленкой и окрашивали 2%-ным водным раствором NANOW. Применялись электронные микроскопы JEM-100 B и LEO912AB.
Для атомно-силовой микроскопии был использован многофункциональный СЗМ "ФемтоCкан" [8] и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Тонкая структура спор и кристаллов были изучены ранее методом ультратонких срезов [1, 2]. На рис.1а и 1b представлены споры в спорангии и свободные споры. В спорангии, помимо споры, присутствует ромбовидный кристалл. Споры связаны со слоистым каноэ, окружены споровой оболочкой и кортексом. Каноэ примыкает к споре с одной стороны. На противоположной стороне споры видна только складчатая споровая оболочка. На представленных микрофотографиях видно, что у штамма 16-92 каноэ узкое, с плотно уложенными слоями.
Ультраструктура штамма B. laterosporus Lat 006 имеет свои особенности. В спорангии рядом со спорой наблюдается кубический кристалл (рис.1c). У зрелых спор штамма Lat 006 обнаружено крупное рыхлое каноэ (рис.1d). Слои каноэ, видимо из-за отсутствия ригидности, располагаются волнообразно. У Lat 006 обнаружены пластинчатые, квадратные кристаллы со сглаженными углами. При лизисе спорангия споры вместе с каноэвидным включением и кристаллы освобождаются раздельно.
На рис.2 представлены изображения электронно-плотных овальных спор B. laterosporus 16-92 с каноэвидным включением.
При использовании контрастирования с помощью NANOW на поверхности спор штамма 16-92 удается наблюдать многочисленные длинные тонкие выросты (рис.3), которые отсутствуют у штамма Lat 006 (рис.4). На рис.4 хорошо видно крупное каноэ, в которое погружена собственно спора Lat 006. На этом изображении также видны квадратные электронно-плотные кристаллы.
Споры и кристаллы B. laterosporus исследованы меньше, чем другие энтомопатогенные бактерии. В особенности это касается каноэ, функция которого не определена, и кристаллов, чья активность по отношению к различным биологическим объектам слабо изучена.
Трехмерное изображение споры B. laterosporus, нанесенной на поверхность свежесколотой слюды, получено с помощью сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан" (Центр перспективных технологий, РФ). Споры B. laterosporus исследованы с помощью метода атомно-силовой микроскопии (рис.5). Наблюдаемый размер споры составил около 1,5 мкм. Построение изображения выполнено в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" [9].
Атомно-силовая микроскопия позволяет получить данные о трехмерном рельефе, оценить объем споры при ее высушивании на воздухе.
Штаммы B. laterosporus специфически активны по отношению к личинкам различных двухкрылых насекомых, в частности, против комаров An. stephensi и Ae. Аegypti. Высокий биоцидный эффект (антибактериальный, фунгицидный, цианолитический) позволяет использовать эти штаммы в качестве продуцентов биологических средств защиты растений от болезней и для борьбы с токсическими микроскопическими водорослями (сине-зелеными бактериями).
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта 15-04-07678.
ЛИТЕРАТУРА
1. Smirnova T.D., Minenkova I., Orlova M.V., Azizbekyan R.R., Lecadet M. The crystal-forming strains of bacillus laterosporus // Research in Microbiology. 1996. Т. 147. № 5. С. 343–350.
2. Orlova M.V., Smirnova T.A., Azizbekyan R.R., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y. Insecticidal activity of bacillus laterosporus // Applied and Environmental Microbiology. 1998. Т. 64. № 7. С. 2723–2725.
3. Fiz-James P.C., Young I.E. Morphological and chemimical studes of the spores and parasporal bodies of Bacillus laterosporus // J. Biochem. Cytol. 1958. 4, С. 639–649.
4. Zubasheva M.V., Smirnova T.A., Azizbekyan R.R., Ganushkina L.A. Larvicidal activity of crystal-forming strains of brevibacillus laterosporus // Applied Biochemistry and Microbiology. 2010. Т. 46. № 8. С. 755–762.
5. Смирнова Т.А., Шевлягина Н.В., Николаенко М.А., Сорокин В.В., Зубашева М.В., Азизбекян Р.Р. Характеристика спор и кристаллов brevibacillus laterosporus // Биотехнология. 2011. № 6. С. 29–37.
6. Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Константинова Г.Е., Ганушкина Л.А., Кузнецова Н.И., Миненкова И.Б., Николаенко М.А., Азизбекян Р.Р. Штамм bacillus laterosporus с множественной биологической активностью // Биотехнология. 1993. № 9. С. 11–15.
7. Смирнова Т.А., Зубашева М.В., Шевлягина Н.В., Николаенко М.А., Азизбекян Р.Р. Электронно-микроскопическое исследование поверхности спор бацилл // Микробиология. 2013. Т. 82. № 6. С. 698–674.
8. Яминский И. Сканирующий зондовый микроскоп ФемтоСкан: новый инструмент для медицины // НАНОИНДУСТРИЯ. 2013. № 5(43). C. 44–46.
9. Yaminsky Y., Filonov A., Sinitsyna O., Meshkov G. FemtoScan Online software // NANOINDUSTRY. 2016. N 2(64). P. 42–46.
Отзывы читателей
