eng
Выпуск #8/2017
А.Ахметова, И.Назаров, Г.Преснова, М.Рубцова, А.Егоров, И.Яминский
Обнаружение белковых биомакромолекул с помощью пьезокерамического биочипа
Обнаружение белковых биомакромолекул с помощью пьезокерамического биочипа
Просмотры: 3860
Рассмотрены конструкция пьезокерамического кантилеверного биочипа и способы обнаружения с его помощью белковых макромолекул для использования в медицине.
УДК 543.07, ВАК 05.11.13, DOI: 10.22184/1993-8578.2017.79.8.44.48
УДК 543.07, ВАК 05.11.13, DOI: 10.22184/1993-8578.2017.79.8.44.48
Теги: biochip biosensor cantilever microalbumin probe microscopy protein macromolecules белковые макромолекулы биосенсоры биочип зондовая микроскопия кантилевер микроальбумин
Применение методов зондовой микроскопии для обнаружения биологических макромолекул является относительно новым направлением. Ранее нами были представлены способы обнаружения вирусов [1] и ДНК [2, 3] с помощью пьезокерамических датчиков. В частности, для обнаружения вируса гриппа А предложен биосенсор, в котором в качестве биоспецифических распознающих реагентов используются сиаловые кислоты, которые способны связываться с гемагглютинином оболочки вируса. Для обнаружения ДНК могут применяться пьезокерамические биочипы, на поверхности которых иммобилизованы олигонуклеотидные зонды известной последовательности. Принцип определения основан на гибридизации этих зондов с комплементарными фрагментами молекул ДНК из анализируемого образца.
Цель данной работы – проверка активности антител на микроальбумин для дальнейшей разработки пьезокерамического биочипа, определяющего микроальбумин с использованием специфических антител. Микроальбуминурия считается предвестником заболеваний внутренних органов, в частности почек, может свидетельствовать о развитии сердечной недостаточности и поражении сосудов. Таким образом, показатель микроальбумина в моче является важным фактором, определяющим общее состояние организма пациента [4].
Для исследования использовались два вида пьезокерамических дисков (рис.1): круглые одиночные пьезокерамические пластинки диаметром 16 мм и толщиной 0,1 мм и сдвоенные диски, состоящие их двух пьезокерамических пластинок диаметром 4 мм и толщиной 0,1 мм каждая. Пластинки диаметром 4 мм вырезались механическим способом из пластин большего размера и затем склеивались таким образом, чтобы направления их поляризации были разными. К электродам пластинок припаивались соединительные провода: по два провода для дисков первого вида и по три для дисков второго вида.
В эксперименте мы использовали шесть дисков диаметром 16 мм и три сдвоенных диска диаметром 4 мм. На все диски с помощью напылительной установки Q300T D (Quorum Technologies Ltd., Великобритания) был нанесен слой золота толщиной 40 нм. Сразу после нанесения золота по три сдвоенных диска диаметром 4 мм и одинарных диска диаметром 16 мм были помещены в раствор 4-аминотиофенола в этиловом спирте с концентрацией 0,16 г/л (набор № 1), а потом три диска диаметром 16 мм (набор № 2) были помещены в этиловый спирт на шесть дней при комнатной температуре.
Применялись мышиные моноклональные антитела ("Иммунотех", Россия) к сывороточному альбумину человека (H-C15, "Биалекса", Россия). На набор дисков № 1 после модификации поверхности аминотиофенолом наносили антитела в растворе EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид гидрохлорида) для ковалентного связывания карбоксильной группы иммуноглобулинов с аминогруппой на поверхности носителя. На диски диаметром 16 мм наносили антитела с EDC в количестве 29 мкл с концентрациями 5, 50 и 100 мкг/мл, на сдвоенные диски диаметром 4 мм – по 5 мкл с такой же концентрацией, после чего их оставляли на 12 ч при температуре –4 °С.
Второй набор дисков помещали на 12 ч в раствор цистамина (меркаптоэтиламина) с концентрацией 0,05 М. Затем на каждый пьезокерамический диск наносили раствор антител с EDC в объеме 29 мкл с концентрациями 5, 50 и 100 мкг/мл.
Диски из первого набора диаметром 16 мм объединили со вторым набором, после чего детектировали иммобилизованные антитела с использованием конъюгата антител козы против антител мыши, меченных пероксидазой хрена. Инкубацию проводили в буфере PBST (фосфатный буферный раствор с твином 20), при детекции ферментативной активности пероксидазы использовали субстрат тетраметилбензидина (TMB).
По результатам проведенного измерения методом ИФА было показано, что для модификации поверхности носителя лучше использовать аминотиофенол, чем цистамин (рис.2).
Параллельно с ИФА проводился эксперимент с пьезокерамическими дисками диаметром 4 мм (набор № 1). Сдвоенные диски с концентрацией антител 50 мкг/мл помещались в проточную систему биосенсора [5]. Для измерения шумов в PBST-буфере определялась зависимость амплитуды колебаний диска от частоты в области резонансного пика. Измерения повторялись с интервалом в 1 с. После этого для каждого измерения вычислялась резонансная частота методом определения центра масс. По данным измерений строился график зависимости резонансной частоты пьезокерамического биочипа от времени (номера измерения – сканирования частоты) (рис.3).
На следующем этапе в буферный раствор был добавлен конъюгат антител козы против антител мыши, меченный пероксидазой. Отношение конъюгата к буферу составило 1 : 4 000 000. Эксперименты проводились при тех же условиях. На рис.4 приведены результаты для пьезокерамического диска диаметром 4 мм с концентрацией антител 50 мкг/мл.
При сравнении результатов измерений разных концентраций специфических антител к альбумину (50 и 5 мкг/мл) выявлено, что при снижении концентрации антител, иммобилизованных на пьезокерамическом диске, уменьшается диапазон изменения значений резонансной частоты, что подтверждает результаты, полученные методом ИФА (рис.2). Отсутствие результата при избыточной концентрации специфических антител (100 мкг/мл), нанесенных на пьезокерамические диски, объясняется тем, что на поверхности образуется несколько монослоев, которые связываются друг с другом за свободные фрагменты. Из-за этого добавленный в систему конъюгат практически не связывается с антителами и не вносит вклад в изменение резонансной частоты. Такой же вывод подтвердил и ИФА-анализ.
Таким образом, разработана методика ковалентной иммобилизации специфических антител на поверхности пьезокерамических биочипов. В дальнейшем биосенсоры могут быть использованы для идентификации микроальбумина. Концентрация микроальбумина в пробе будет определяться по сдвигу резонансной частоты. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения пьезокерамического биосенсора для обнаружения белковых биомакромолекул.
Следует заметить, что существенное увеличение чувствительности пьезокерамического кантилеверного биосенсора можно будет получить при выборе оптимальной геометрии биочипа. Уменьшение геометрических размеров биочипа до микронных размеров позволит многократно повысить чувствительность метода. Технологически реализуемы следующие размеры биочипа: диаметр – 50–100 мкм, толщина – 5–10 мкм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахметова А., Гутник Н., Мешков Г. и др. Биосенсор для обнаружения вирусов и бактерий в жидкостях // НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. Т. 70. № 8. С. 22–27.
2. Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю. и др. Применение атомно-силовой микроскопии для 3D-анализа результатов гибридизации нуклеиновых кислот на микрочипах // Acta naturae. 2015. Т. 7. С. 117–124.
3. Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю. и др. Раннее обнаружение инфекционных заболеваний методом атомно-силовой микроскопии с использованием ДНК-микрочипов // Медицина и высокие технологии. 2015. № 3. С. 34–37.
4. Морозов Ю.А., Марченко Т.В., Исаева А.М. Микроальбуминурия: патофизиологические аспекты и лабораторные методы определения // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. 2012. № 4. С. 30–35.
5. Яминский И.В., Ахметова А.И., Мешков Г.Б. Физические методы обнаружения вирусов и бактерий c использованием инструментов сканирующей зондовой микроскопии // НАНОИНДУСТРИЯ. 2017. Т. 3. № 73. С. 56–59.
T
Цель данной работы – проверка активности антител на микроальбумин для дальнейшей разработки пьезокерамического биочипа, определяющего микроальбумин с использованием специфических антител. Микроальбуминурия считается предвестником заболеваний внутренних органов, в частности почек, может свидетельствовать о развитии сердечной недостаточности и поражении сосудов. Таким образом, показатель микроальбумина в моче является важным фактором, определяющим общее состояние организма пациента [4].
Для исследования использовались два вида пьезокерамических дисков (рис.1): круглые одиночные пьезокерамические пластинки диаметром 16 мм и толщиной 0,1 мм и сдвоенные диски, состоящие их двух пьезокерамических пластинок диаметром 4 мм и толщиной 0,1 мм каждая. Пластинки диаметром 4 мм вырезались механическим способом из пластин большего размера и затем склеивались таким образом, чтобы направления их поляризации были разными. К электродам пластинок припаивались соединительные провода: по два провода для дисков первого вида и по три для дисков второго вида.
В эксперименте мы использовали шесть дисков диаметром 16 мм и три сдвоенных диска диаметром 4 мм. На все диски с помощью напылительной установки Q300T D (Quorum Technologies Ltd., Великобритания) был нанесен слой золота толщиной 40 нм. Сразу после нанесения золота по три сдвоенных диска диаметром 4 мм и одинарных диска диаметром 16 мм были помещены в раствор 4-аминотиофенола в этиловом спирте с концентрацией 0,16 г/л (набор № 1), а потом три диска диаметром 16 мм (набор № 2) были помещены в этиловый спирт на шесть дней при комнатной температуре.
Применялись мышиные моноклональные антитела ("Иммунотех", Россия) к сывороточному альбумину человека (H-C15, "Биалекса", Россия). На набор дисков № 1 после модификации поверхности аминотиофенолом наносили антитела в растворе EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид гидрохлорида) для ковалентного связывания карбоксильной группы иммуноглобулинов с аминогруппой на поверхности носителя. На диски диаметром 16 мм наносили антитела с EDC в количестве 29 мкл с концентрациями 5, 50 и 100 мкг/мл, на сдвоенные диски диаметром 4 мм – по 5 мкл с такой же концентрацией, после чего их оставляли на 12 ч при температуре –4 °С.
Второй набор дисков помещали на 12 ч в раствор цистамина (меркаптоэтиламина) с концентрацией 0,05 М. Затем на каждый пьезокерамический диск наносили раствор антител с EDC в объеме 29 мкл с концентрациями 5, 50 и 100 мкг/мл.
Диски из первого набора диаметром 16 мм объединили со вторым набором, после чего детектировали иммобилизованные антитела с использованием конъюгата антител козы против антител мыши, меченных пероксидазой хрена. Инкубацию проводили в буфере PBST (фосфатный буферный раствор с твином 20), при детекции ферментативной активности пероксидазы использовали субстрат тетраметилбензидина (TMB).
По результатам проведенного измерения методом ИФА было показано, что для модификации поверхности носителя лучше использовать аминотиофенол, чем цистамин (рис.2).
Параллельно с ИФА проводился эксперимент с пьезокерамическими дисками диаметром 4 мм (набор № 1). Сдвоенные диски с концентрацией антител 50 мкг/мл помещались в проточную систему биосенсора [5]. Для измерения шумов в PBST-буфере определялась зависимость амплитуды колебаний диска от частоты в области резонансного пика. Измерения повторялись с интервалом в 1 с. После этого для каждого измерения вычислялась резонансная частота методом определения центра масс. По данным измерений строился график зависимости резонансной частоты пьезокерамического биочипа от времени (номера измерения – сканирования частоты) (рис.3).
На следующем этапе в буферный раствор был добавлен конъюгат антител козы против антител мыши, меченный пероксидазой. Отношение конъюгата к буферу составило 1 : 4 000 000. Эксперименты проводились при тех же условиях. На рис.4 приведены результаты для пьезокерамического диска диаметром 4 мм с концентрацией антител 50 мкг/мл.
При сравнении результатов измерений разных концентраций специфических антител к альбумину (50 и 5 мкг/мл) выявлено, что при снижении концентрации антител, иммобилизованных на пьезокерамическом диске, уменьшается диапазон изменения значений резонансной частоты, что подтверждает результаты, полученные методом ИФА (рис.2). Отсутствие результата при избыточной концентрации специфических антител (100 мкг/мл), нанесенных на пьезокерамические диски, объясняется тем, что на поверхности образуется несколько монослоев, которые связываются друг с другом за свободные фрагменты. Из-за этого добавленный в систему конъюгат практически не связывается с антителами и не вносит вклад в изменение резонансной частоты. Такой же вывод подтвердил и ИФА-анализ.
Таким образом, разработана методика ковалентной иммобилизации специфических антител на поверхности пьезокерамических биочипов. В дальнейшем биосенсоры могут быть использованы для идентификации микроальбумина. Концентрация микроальбумина в пробе будет определяться по сдвигу резонансной частоты. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения пьезокерамического биосенсора для обнаружения белковых биомакромолекул.
Следует заметить, что существенное увеличение чувствительности пьезокерамического кантилеверного биосенсора можно будет получить при выборе оптимальной геометрии биочипа. Уменьшение геометрических размеров биочипа до микронных размеров позволит многократно повысить чувствительность метода. Технологически реализуемы следующие размеры биочипа: диаметр – 50–100 мкм, толщина – 5–10 мкм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахметова А., Гутник Н., Мешков Г. и др. Биосенсор для обнаружения вирусов и бактерий в жидкостях // НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. Т. 70. № 8. С. 22–27.
2. Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю. и др. Применение атомно-силовой микроскопии для 3D-анализа результатов гибридизации нуклеиновых кислот на микрочипах // Acta naturae. 2015. Т. 7. С. 117–124.
3. Дубровин Е.В., Преснова Г.В., Рубцова М.Ю. и др. Раннее обнаружение инфекционных заболеваний методом атомно-силовой микроскопии с использованием ДНК-микрочипов // Медицина и высокие технологии. 2015. № 3. С. 34–37.
4. Морозов Ю.А., Марченко Т.В., Исаева А.М. Микроальбуминурия: патофизиологические аспекты и лабораторные методы определения // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. 2012. № 4. С. 30–35.
5. Яминский И.В., Ахметова А.И., Мешков Г.Б. Физические методы обнаружения вирусов и бактерий c использованием инструментов сканирующей зондовой микроскопии // НАНОИНДУСТРИЯ. 2017. Т. 3. № 73. С. 56–59.
T
Отзывы читателей
