eng
Представлен обзор последних достижений сканирующей зондовой микроскопии в решении практических задач в области биологии и медицины. Продемонстрированы уникальные возможности сканирующей капиллярной микроскопии при наблюдении морфологии единичных клеток и изучении проводимости ионных каналов мембраны клеток. Особое внимание уделено описанию принципа молекулярной печати с помощью техники сканирующей капиллярной микроскопии. Приведены данные о создании капиллярных бионаносенсоров.
УДК 621.385.833; ВАК 05.11.13; DOI: 10.22184/1993-8578.2018.81.2.132.136
УДК 621.385.833; ВАК 05.11.13; DOI: 10.22184/1993-8578.2018.81.2.132.136
Теги: atomic force microscopy biosensors scanning capillary microscopy stereolithography атомно-силовая микроскопия биосенсоры сканирующая капиллярная микроскопия стереолитография
Среди первостепенных задач биомедицинской сканирующей зондовой микроскопии можно отметить следующие направления:
• раннее обнаружение биологических агентов (вирусов и бактерий) и различных биологических мишеней в воздухе и биологических жидкостях;
• определение морфологии и качества клеток человека, разработка количественного метода экспресс-анализа клеток;
• создание атласа бактериальных клеток по данным сканирующей зондовой микроскопии для диагностических целей;
• разработка методов обнаружения ДНК вирусов и патогенных бактерий методом прямого наблюдения актов гибридизации на поверхности биочипов с помощью сканирующей зондовой микроскопии;
• создание методов обнаружения вирусов и патогенных клеток с применением аффинных поверхностей.
За последнее десятилетие произошел качественный скачок в развитии ряда методов сканирующей зондовой микроскопии, в том числе – сканирующей капиллярной микроскопии [1, 2]. Замечено, что при наблюдении живых клеток капиллярная микроскопия позволяет получить более точные изображения, поскольку отсутствует силовое взаимодействие между зондом (капилляром) и мембраной клетки [3]. Вместе с тем, высокоскоростная атомно-силовая микроскопия позволяет наблюдать биологические процессы на уровне единичных биомакромолекул с высокими разрешением и скоростью [4]. В целом можно уверенно констатировать, что в умелых руках современные модели сканирующего капиллярного и атомно-силового микроскопов становятся чрезвычайно полезными инструментами для решения задач биологии и медицины. Для биомедицинских целей нами разработан быстродействующий сканирующий зондовый микроскоп "ФемтоСкан Х", в котором обратная связь работает на частоте 1 МГц [5].
СКАНИРУЮЩАЯ КАПИЛЛЯРНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Новые возможности для медицины открывает сканирующая ион-проводящая микроскопия или сканирующая капиллярная микроскопия. В дополнение к наблюдению топографии с высоким разрешением сканирующая капиллярная микроскопия может выполнять многофункциональный анализ живых клеток, включая наблюдение морфологических трансформаций, вызванных физиологическими воздействиями, идентификацию внутриклеточных сигнальных путей и определение характеристик механических ответов, что демонстрирует универсальность метода. Использование многоканальных нанокапилляров позволяет осуществлять локальную доставку химических веществ (медицинских препаратов) до непосредственного контакта с клеткой. Такой нанокапилляр может также являться электрохимическим зондом для определения различных жизненно важных параметров, например, концентрации активных форм кислорода вблизи поверхности живой клетки, а также внутри нее [6].
РАННЕЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА С ПОМОЩЬЮ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Раннее обнаружение вирусов и бактерий в жидкости позволяет существенно снизить риск инфекционных заболеваний. Эта актуальная и социально значимая задача является достаточно сложной и требует инновационных решений.
Нами осуществлена разработка компактного и недорогого биосенсора для обнаружения различных биологических мишеней – вируса гриппа А, микроальбумина, простат-специфического антигена и пр. Ключевым элементом биосенсора является кантилеверный биочип – пьезокерамический диск, поверхность которого покрыта биоспецифическими сенсорными слоями. Связывание мишени с поверхностью биочипа определяется по изменению резонансной частоты пьезокерамического диска. В результате взаимодействия патогенов с рецепторным слоем биочипа эффективная масса и жесткость последнего будут изменяться, что может быть зарегистрировано по сдвигу резонансной частоты кантилевера:
,
где Δf, Δk, Δm – изменения резонансной частоты, жесткости и массы биочипа, а fn, k и m – первоначальные значения этих параметров.
В блоке управления биосенсора используются электронные платы сканирующего зондового микроскопа, в том числе цифровой синтезатор частоты, прецизионный усилитель входного сигнала, интерфейс для связи с компьютерным блоком, термостат проточной жидкостной ячейки, ЦАП-АЦП, стабилизированное питание, цифровой сигнальный процессор. Ряд технологических решений – симметрия конструкции биочипа и электронной схемы подачи и снятия сигнала позволили существенно повысить точность и достоверность измерений [7].
В проведенных экспериментах достигнута чувствительность по обнаружению вируса гриппа А на уровне 105 ед. в мл [8]. Продемонстрирована возможность выявления низких концентраций микроальбумина в биологических жидкостях с помощью пьезокерамического биочипа с сенсорными слоями на основе моноклональных антител [9].
Использование оригинальной конструкции проточной жидкостной ячейки и пьезокерамического биочипа в качестве подложки в составе сканирующего зондового микроскопа позволяет в реальном времени наблюдать адсорбцию отдельных вирусных частиц с одновременной регистрацией сдвига резонансной частоты механических колебаний биочипа. С помощью таких измерений можно осуществлять калибровку биочипа, что необходимо для практических применений в медицине. Точное измерение размеров вирусных частиц можно выполнять с помощью разработанного ранее эталона нанометра [10].
КАПИЛЛЯРНАЯ СТЕРЕОЛИТОГРАФИЯ
С момента своего появления атомно-силовая микроскопия применяется для реализации различных режимов нанолитографии с помощью силового, теплового или электрического воздействия. Сканирующая капиллярная микроскопия стала эффективным инструментом направленного массопереноса отдельных биомакромолекул, наночастиц и пр. [11]. Многоканальные зонды можно использовать для 3D-печати заданных молекулярных конфигураций. Подача макромолекул через капилляр проводится различными способами, например, с помощью электрофореза или путем создания в капилляре избыточного давления.
Двумерная литография флуоресцентными белками была успешно выполнена на сканирующем ион-проводящем микроскопе с применением двухканального капилляра в работе [11]. Таким способом была создана цветная миниатюрная копия картины Дега "Танцовщицы". Размер миниатюры соответствовал диаметру волоса (около 50 мкм).
Сканирующая капиллярная стереолитография имеет определенные преимущества по сравнению с лазерной стереолитографией, пространственное разрешение которой ограничено дифракционным пределом, составляющим около половины длины волны лазерного излучения. В капиллярной микроскопии достигается нанометровая и субнанометровая точность позиционирования. Диаметр выходного капилляра может варьироваться в диапазоне от единиц до сотен нанометров, что открывает возможность создания молекулярного 3D-принтера.
При изготовлении одноканальных или многоканальных нанокапилляров для стереолитографии используются стеклянные микротрубочки из кварца или боросиликатного стекла, широко применяемые для решения электрофизиологических задач.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Можно прогнозировать дальнейшее расширение использования сканирующего капиллярного микроскопа в биомедицинских приложениях и тестировании лекарственных средств с использованием всего лишь одной клетки, а не их культуры [12]. Также быстро и успешно развиваются практические применения сканирующей зондовой микроскопии для задач молекулярной медицины, в частности, раннего обнаружения вирусов в воздушных средах и жидкостях.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (проекты 17-52-560001 и 16-29-06290).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Novak P., Li Ch., Shevchuk A., et al. Nature Methods. 6 (4). 2009. 279.
2. Seifert J., Rheinlaender J., Lang F., Gawaz M., Schдffer T.E. Scientific Reports. 7. 2017. 4810.
3. Seifert J., Rheinlaender J., Novak P., Korchev Y.E., Schдffer T.E. Langmuir. 31. 2015. 6807–6813.
4. Kodera N., et al. Nature. 468. 2010. 72.
5. Яминский И. НАНОИНДУСТРИЯ. 2015. 5 (59). 40–43.
Yaminsky I. NANOINDUSTRY. 2015. 5 (59). 40–43.
6. Actis P., Tokar S., Clausmeyer J., Babakinejad B., et al. ACS Nano. 8 (1). 2014. 875–884.
7. Ахметова А.И., Назаров И.А., Яминский И.В. Медицина и высокие технологии. 1. 2017. 5.
Akhmetova A.I., Nazarov I.A., Yaminsky I.V. Medicine and high technologies. 1. 2017. 5.
8. Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., et al. Analyst. 140. 2015. 6131.
9. Ахметова А., Назаров И., Преснова Г., et al. НАНОИНДУСТРИЯ. 2017. 8 (79). 44.
Akhmetova A., Nazarov I., Presnov G., et al. NANOINDUSTRY. 2017. 8 (79). 44.
10. Мешков Г.Б., Яминский Д.И., Яминский И.В. Патент на изобретение № 2538029. опубликовано 10.01.2015.
Meshkov G.B., Yaminsky D.I., Yaminsky I.V. Patent for invention No. 2538029. Published on January 10, 2015.
11. Rodolfa K.T., Bruckbauer A., Zhou D. et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2005. 44. 6854.
12. Яминский И. НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. 1(63). 76.
Yaminsky I. NANOINDUSTRY. 2016. 1 (63). 76.
• раннее обнаружение биологических агентов (вирусов и бактерий) и различных биологических мишеней в воздухе и биологических жидкостях;
• определение морфологии и качества клеток человека, разработка количественного метода экспресс-анализа клеток;
• создание атласа бактериальных клеток по данным сканирующей зондовой микроскопии для диагностических целей;
• разработка методов обнаружения ДНК вирусов и патогенных бактерий методом прямого наблюдения актов гибридизации на поверхности биочипов с помощью сканирующей зондовой микроскопии;
• создание методов обнаружения вирусов и патогенных клеток с применением аффинных поверхностей.
За последнее десятилетие произошел качественный скачок в развитии ряда методов сканирующей зондовой микроскопии, в том числе – сканирующей капиллярной микроскопии [1, 2]. Замечено, что при наблюдении живых клеток капиллярная микроскопия позволяет получить более точные изображения, поскольку отсутствует силовое взаимодействие между зондом (капилляром) и мембраной клетки [3]. Вместе с тем, высокоскоростная атомно-силовая микроскопия позволяет наблюдать биологические процессы на уровне единичных биомакромолекул с высокими разрешением и скоростью [4]. В целом можно уверенно констатировать, что в умелых руках современные модели сканирующего капиллярного и атомно-силового микроскопов становятся чрезвычайно полезными инструментами для решения задач биологии и медицины. Для биомедицинских целей нами разработан быстродействующий сканирующий зондовый микроскоп "ФемтоСкан Х", в котором обратная связь работает на частоте 1 МГц [5].
СКАНИРУЮЩАЯ КАПИЛЛЯРНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Новые возможности для медицины открывает сканирующая ион-проводящая микроскопия или сканирующая капиллярная микроскопия. В дополнение к наблюдению топографии с высоким разрешением сканирующая капиллярная микроскопия может выполнять многофункциональный анализ живых клеток, включая наблюдение морфологических трансформаций, вызванных физиологическими воздействиями, идентификацию внутриклеточных сигнальных путей и определение характеристик механических ответов, что демонстрирует универсальность метода. Использование многоканальных нанокапилляров позволяет осуществлять локальную доставку химических веществ (медицинских препаратов) до непосредственного контакта с клеткой. Такой нанокапилляр может также являться электрохимическим зондом для определения различных жизненно важных параметров, например, концентрации активных форм кислорода вблизи поверхности живой клетки, а также внутри нее [6].
РАННЕЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА С ПОМОЩЬЮ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Раннее обнаружение вирусов и бактерий в жидкости позволяет существенно снизить риск инфекционных заболеваний. Эта актуальная и социально значимая задача является достаточно сложной и требует инновационных решений.
Нами осуществлена разработка компактного и недорогого биосенсора для обнаружения различных биологических мишеней – вируса гриппа А, микроальбумина, простат-специфического антигена и пр. Ключевым элементом биосенсора является кантилеверный биочип – пьезокерамический диск, поверхность которого покрыта биоспецифическими сенсорными слоями. Связывание мишени с поверхностью биочипа определяется по изменению резонансной частоты пьезокерамического диска. В результате взаимодействия патогенов с рецепторным слоем биочипа эффективная масса и жесткость последнего будут изменяться, что может быть зарегистрировано по сдвигу резонансной частоты кантилевера:
,
где Δf, Δk, Δm – изменения резонансной частоты, жесткости и массы биочипа, а fn, k и m – первоначальные значения этих параметров.
В блоке управления биосенсора используются электронные платы сканирующего зондового микроскопа, в том числе цифровой синтезатор частоты, прецизионный усилитель входного сигнала, интерфейс для связи с компьютерным блоком, термостат проточной жидкостной ячейки, ЦАП-АЦП, стабилизированное питание, цифровой сигнальный процессор. Ряд технологических решений – симметрия конструкции биочипа и электронной схемы подачи и снятия сигнала позволили существенно повысить точность и достоверность измерений [7].
В проведенных экспериментах достигнута чувствительность по обнаружению вируса гриппа А на уровне 105 ед. в мл [8]. Продемонстрирована возможность выявления низких концентраций микроальбумина в биологических жидкостях с помощью пьезокерамического биочипа с сенсорными слоями на основе моноклональных антител [9].
Использование оригинальной конструкции проточной жидкостной ячейки и пьезокерамического биочипа в качестве подложки в составе сканирующего зондового микроскопа позволяет в реальном времени наблюдать адсорбцию отдельных вирусных частиц с одновременной регистрацией сдвига резонансной частоты механических колебаний биочипа. С помощью таких измерений можно осуществлять калибровку биочипа, что необходимо для практических применений в медицине. Точное измерение размеров вирусных частиц можно выполнять с помощью разработанного ранее эталона нанометра [10].
КАПИЛЛЯРНАЯ СТЕРЕОЛИТОГРАФИЯ
С момента своего появления атомно-силовая микроскопия применяется для реализации различных режимов нанолитографии с помощью силового, теплового или электрического воздействия. Сканирующая капиллярная микроскопия стала эффективным инструментом направленного массопереноса отдельных биомакромолекул, наночастиц и пр. [11]. Многоканальные зонды можно использовать для 3D-печати заданных молекулярных конфигураций. Подача макромолекул через капилляр проводится различными способами, например, с помощью электрофореза или путем создания в капилляре избыточного давления.
Двумерная литография флуоресцентными белками была успешно выполнена на сканирующем ион-проводящем микроскопе с применением двухканального капилляра в работе [11]. Таким способом была создана цветная миниатюрная копия картины Дега "Танцовщицы". Размер миниатюры соответствовал диаметру волоса (около 50 мкм).
Сканирующая капиллярная стереолитография имеет определенные преимущества по сравнению с лазерной стереолитографией, пространственное разрешение которой ограничено дифракционным пределом, составляющим около половины длины волны лазерного излучения. В капиллярной микроскопии достигается нанометровая и субнанометровая точность позиционирования. Диаметр выходного капилляра может варьироваться в диапазоне от единиц до сотен нанометров, что открывает возможность создания молекулярного 3D-принтера.
При изготовлении одноканальных или многоканальных нанокапилляров для стереолитографии используются стеклянные микротрубочки из кварца или боросиликатного стекла, широко применяемые для решения электрофизиологических задач.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Можно прогнозировать дальнейшее расширение использования сканирующего капиллярного микроскопа в биомедицинских приложениях и тестировании лекарственных средств с использованием всего лишь одной клетки, а не их культуры [12]. Также быстро и успешно развиваются практические применения сканирующей зондовой микроскопии для задач молекулярной медицины, в частности, раннего обнаружения вирусов в воздушных средах и жидкостях.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (проекты 17-52-560001 и 16-29-06290).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Novak P., Li Ch., Shevchuk A., et al. Nature Methods. 6 (4). 2009. 279.
2. Seifert J., Rheinlaender J., Lang F., Gawaz M., Schдffer T.E. Scientific Reports. 7. 2017. 4810.
3. Seifert J., Rheinlaender J., Novak P., Korchev Y.E., Schдffer T.E. Langmuir. 31. 2015. 6807–6813.
4. Kodera N., et al. Nature. 468. 2010. 72.
5. Яминский И. НАНОИНДУСТРИЯ. 2015. 5 (59). 40–43.
Yaminsky I. NANOINDUSTRY. 2015. 5 (59). 40–43.
6. Actis P., Tokar S., Clausmeyer J., Babakinejad B., et al. ACS Nano. 8 (1). 2014. 875–884.
7. Ахметова А.И., Назаров И.А., Яминский И.В. Медицина и высокие технологии. 1. 2017. 5.
Akhmetova A.I., Nazarov I.A., Yaminsky I.V. Medicine and high technologies. 1. 2017. 5.
8. Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., et al. Analyst. 140. 2015. 6131.
9. Ахметова А., Назаров И., Преснова Г., et al. НАНОИНДУСТРИЯ. 2017. 8 (79). 44.
Akhmetova A., Nazarov I., Presnov G., et al. NANOINDUSTRY. 2017. 8 (79). 44.
10. Мешков Г.Б., Яминский Д.И., Яминский И.В. Патент на изобретение № 2538029. опубликовано 10.01.2015.
Meshkov G.B., Yaminsky D.I., Yaminsky I.V. Patent for invention No. 2538029. Published on January 10, 2015.
11. Rodolfa K.T., Bruckbauer A., Zhou D. et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2005. 44. 6854.
12. Яминский И. НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. 1(63). 76.
Yaminsky I. NANOINDUSTRY. 2016. 1 (63). 76.
Отзывы читателей
