eng
Выпуск #2/2020
М.В.Зубашева, Ю.А.Смирнов, Т.А.Смирнова, Р.Р.Азизбекян, В.Г.Жуховицкий, И.В.Яминский
Наноструктура белковых кристаллов бактерий Brevibacillus laterosporus
Наноструктура белковых кристаллов бактерий Brevibacillus laterosporus
Просмотры: 2430
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.2.126.131
В работе представлена информация о бактерии B. laterosporus, способной образовывать белковые кристаллы, токсичные для некоторых насекомых, что делает данные кристаллы безопасным и экологичным средством для борьбы с москитами. Исследована тонкая структура белковых кристаллов, приведены экспериментальные данные о полученных изображениях методом электронной микроскопии.
В работе представлена информация о бактерии B. laterosporus, способной образовывать белковые кристаллы, токсичные для некоторых насекомых, что делает данные кристаллы безопасным и экологичным средством для борьбы с москитами. Исследована тонкая структура белковых кристаллов, приведены экспериментальные данные о полученных изображениях методом электронной микроскопии.
Теги: brevibacillus laterosporus entomopathogenic bacteria mosquito-toxic properties protein crystalline δ-endotoxin protein crystals белковые кристаллы белковый кристаллический δ-эндотоксин москитоцидные свойства энтомопатогенные бактерии
Наноструктура белковых кристаллов бактерий Brevibacillus laterosporus
Nanostructure of protein crystals of bacteria Brevibacillus laterosporus
М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр. лаб. индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов, (ORCID: 0000-0001-7330-7343), Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр. лаб. онтогенеза вирусов, (ORCID: 0000-0002-2215-5420), Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр. лаб. индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов, (ORCID: 0000-0001-7121-635Х), Р.Р.Азизбекян4, д.б.н., проф., начальник лаб. БАС, (ORCID: 0000-0003-2569-7820), В.Г.Жуховицкий1, к.м.н., руководитель лаб. индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов, (ORCID: 0000-0002-4653-2446), И.В.Яминский2, 3, 5 д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова, вед. научн. сотр. ИНЭОС РАН, директор Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0001-8731-3947) / yaminsky@nanoscopy.ru
M.V.Zubasheva1, Cand. of Sc. (Biology), Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sc. (Medical), Prof., T.A.Smirnova1, Doct. of. Sc. (Biology), R.R.Azizbekyan4, Doct. of Sc. (Biology), Prof., V.G.Zhukhovitsky1, Cand. of Sc. (Medical), I.V.Yaminskiy2, 3, 5, Doctor of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Physical and Chemical departments of Lomonosov Moscow State University, Leader Scientist of INEOS RAS, Director of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.2.126.131
Получено: 10.03.2020 г.
В работе представлена информация о бактерии Brevibacillus laterosporus, способной образовывать белковые кристаллы, токсичные для некоторых насекомых, что позволяет рассматривать данные кристаллы безопасным и экологичным средством для борьбы с москитами. Исследована тонкая структура белковых кристаллов, приведены экспериментальные данные о полученных изображениях методом электронной микроскопии.
The article provides information about bacterium Brevibacillus laterosporus capable to form protein crystals, toxic to some insects, which allows us to consider these crystals as safe and environmentally friendly product in the fight against mosquitoes. A fine structure of protein crystals was studied and experimental data of the electron microscopy images were obtained.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в связи с распространенностью заболеваний, передающихся с помощью двукрылых насекомых, особое внимание уделяется биологическим методам борьбы с использованием энтомопатогенных бактерий, главным образом, Bac. thuringiensis (Вt). Основной вклад в развитие инфекционного процесса у насекомых при заражении Bt вносит белковый кристаллический δ-эндотоксин, синтезирующийся в процессе споруляции [1].
Белковые кристаллы эндотоксина образуются одновременно со спорами по одному, реже по два в каждой бактериальной клетке. Они токсичны для насекомых отрядов чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых.
Способность к кристаллообразованию у бактерий Brevibacillus laterosporus (Bl) до недавнего времени не была установлена. Бациллы Bl, в отличие от Bt, относятся к малоизученным энтомопатогенным бактериям. Их особенность в наличии каноэвидного включения, прикрепленного к споре.
Ранее нами были получены и охарактеризованы штаммы Bl, способные образовывать параспоральные кристаллы [2]. У исследованных штаммов Bl удалось обнаружить кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам, подобные тем, что описаны для энтомопатогенных бактерий Bt и B. sphaericus [3]. Кристаллы Bl обладают москитоцидными свойствами (токсичны для двукрылых), что важно в связи с возможностью их практического использования в случае развития устойчивости у личинок комаров к имеющимся инсектицидным препаратам на основе Вt [4]. Кристаллы Bl мало исследованы. Их сохранение в окружающей среде и проявление токсичности в организме хозяина зависят от физико-химических свойств, обусловленных их структурной организацией.
Различными микроскопическими методами ранее изучались споры и кристаллы нативных клеток B. laterosporus. С помощью атомно-силовой микроскопии получено трехмерное изображение спор [6]. Вид нативного каноэ дает возможность оценить его позицию по отношению собственно к споре. Однако кристаллы были недостаточно охарактеризованными. В настоящей работе получены данные об ультраструктурной организации кристаллов B. laterosporus.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы Bl были получены из лабораторной коллекции ВНИИ Генетика (Bl 16-92) и коллекции Института Пастера (Париж) от д-ра Lecadet (Lat 006). Штаммы выращивали на агаризованной среде NBY в течение 72 ч при 30 °С.
Электронная микроскопия. Споры и кристаллы смывали с агара, суспендировали, промывали в дистиллированной воде и исследовали методами ультратонких срезов и негативного контрастирования [2]. Суспензию спор и кристаллов для изучения методом негативного контрастирования наносили на сетки, покрытые углеродной пленкой и окрашивали контрастером фосфорно-вольфрамовой кислоты NANOWtm. Структура образцов изучена с помощью электронных микроскопов JEM-100B и LEO912AB (Zeiss). Параметры решетки кристалла BL 16-92 были определены по полученной дифракционной картине с помощью просвечивающего электронного микроскопа LEO912AB (Zeiss).
Обработка изображения проведена в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" (Центр перспективных технологий, РФ) [7, 8, 9, 10].
РЕЗУЛЬТАТЫ
У штаммов Bl 16-92, Lat 006 были обнаружены кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам, На рис.1a, b и рис.2a, b представлены данные, полученные при изучении ультратонких срезов этих штаммов. Кристаллы хорошо видны на срезах спорулирующих клеток. У штамма Bl 16-92 кристаллы, в основном, имеют ромбовидную форму (рис.1a, b). У штамма Lat 006 кристаллы имеют кубическую форму (рис.2a) или вытянутую форму с закругленными концами (рис.2b). Кристаллы окружены сетчатой оболочкой равномерной толщины, особенно хорошо видной у штамма Bl 16-92 (рис.1a).
При негативном контрастировании у штамма Bl 16-92 также видны ромбические кристаллы с четко очерченными углами размером, в основном, 0,4 × 0,3 мкм. Штамм Lat 006 имеет прямоугольные кристаллические включения размером 0,2 × 0,7 мкм или квадратные со сглаженными углами кристаллы размером 0,4 × 0,4 мкм и меньше. Встречаются кристаллы менее правильной формы.
Кристаллы штамма Lat 006 отличаются от кристаллов штамма Bl 16-92 не только формой, но и большей электронной плотностью. Однако они сходны с кристаллами Bl 16-92 наличием оболочки, изолирующей их от воздействия факторов внешней среды.
При негативном контрастировании особенно четко выявляются электронно-плотные кристаллы Lat 006 (рис.3, 4, 5).
На поверхности белкового кристалла наблюдается периодическое упорядочение молекул. На рис.6 приведено характерное изображение фрагмента поверхности белкового кристалла, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии. Для кристалла характерна кубическая упаковка с периодом около 4,5 нм.
Для сравнения ранее нами исследовались инсектицидные кристаллы Bt var. galleriae методом негативного контрастирования, токсичных для чешуекрылых насекомых, и была обнаружена параллельная исчерченность поверхности кристаллов с периодом около 20 нм [5]. Этим методом были изучены и кристаллы Bt var. israelensis, обладающие москитоцидной активностью. При электронной микроскопии этих кристаллов, негативно окрашенных 2%-ным молибдатом аммония, на поверхности наблюдали решетку из частых поперечных линий с периодом 7 нм. У кристаллов, токсичных для двукрылых, не удавалось выявить исчерченность, характерную для кристаллов, токсичных для чешуекрылых.
Проекционное изображение одиночного кристалла клеток B. laterosporus Lat 006, полученное на просвечивающем электронном микроскопе LEO 912AB, представлено на рис.7.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе получены данные об ультраструктурной организации кристаллов B. laterosporus. Их структура оказалась сходной по размерам кристаллической решетки с кристаллами Bt var. israelensis, токсичными для личинок комаров. Независимо от принадлежности к виду бацилл особенности строения кристаллов вероятно в большей степени определяются свойствами объекта их инсектицидного действия.
Характерный размер упаковки белков в кристаллах B. laterosporus – около 4,5 нм. Размеры кристаллов варьируются в пределах 50–700 нм. При этом кристалл кубической формы с гранью в 250 нм содержит в себе около 170 тыс. белковых субъединиц.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H. Bac. thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. Vol. 62. P. 775–806.
Smirnova T.A., Minenkova I.B., Orlova M.V., Azizbekyan R.R., Lecadet M. The crystal-forming strains of bacillus laterosporus // Research in Microbiology. 1996. Vol. 147. No. 5. P. 343–350.
Charles J-F., Nielsen-LeRoux C. and Delecluse A. Bacillus sphaericus toxins: molecular biology and mode of action // Annu. Rev. Entomol. 1996. Vol. 41. P. 451–472.
Orlova M.V., Smirnova T.A., Azizbekyan R.R., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y. Insecticidal activity of bacillus laterosporus. Applied and Environmental Microbiology. 1998. Vol. 64. No. 7. P. 2723–2725.
Smirnova T.A., Mikhailov A.M., Tiurin V.S., Azizbekian R.R. Ultrastructure of the bacterial spores and crystals of various Bacillus huringiensis serotypes // Mikrobiologiya. 1984. No. 53. P. 455–462.
Zubasheva M., Sagitova A., Smirnov Yu., Smirnova T., Azizbekyan R., Zhukhovitsky V., Yaminsky I. Ultrastructural analysis of Brevibacillus laterosporus bacterial cells using electron and atomic force microscopy // Nanoindustry. 2017. No. 2 (72). P. 74–78.
Yaminsky I., Filonov A., Sinitsyna O., Meshkov G. FemtoScan Online software // Nanoindustry. 2016. No. 2(64). P. 42–46.
Akhmetova A., Yaminsky I. 20 years since FemtoScan shows atoms // Nanoindustry. 2017. No. 2(72). P. 88–89.
Filonov A., Yaminsky I., Akhmetova A., Meshkov G. FemtoScan Online. Why? // Nanoindustry. 2018. Vol. 11. No. 5(84). P. 336–342.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online Software and Visualization of Nano-Objects in High-Resolution Microscopy // Nanoindustry. 2018. Vol. 11. No. 6 (85). P. 414–416.
Nanostructure of protein crystals of bacteria Brevibacillus laterosporus
М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр. лаб. индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов, (ORCID: 0000-0001-7330-7343), Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр. лаб. онтогенеза вирусов, (ORCID: 0000-0002-2215-5420), Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр. лаб. индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов, (ORCID: 0000-0001-7121-635Х), Р.Р.Азизбекян4, д.б.н., проф., начальник лаб. БАС, (ORCID: 0000-0003-2569-7820), В.Г.Жуховицкий1, к.м.н., руководитель лаб. индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов, (ORCID: 0000-0002-4653-2446), И.В.Яминский2, 3, 5 д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова, вед. научн. сотр. ИНЭОС РАН, директор Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0001-8731-3947) / yaminsky@nanoscopy.ru
M.V.Zubasheva1, Cand. of Sc. (Biology), Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sc. (Medical), Prof., T.A.Smirnova1, Doct. of. Sc. (Biology), R.R.Azizbekyan4, Doct. of Sc. (Biology), Prof., V.G.Zhukhovitsky1, Cand. of Sc. (Medical), I.V.Yaminskiy2, 3, 5, Doctor of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Physical and Chemical departments of Lomonosov Moscow State University, Leader Scientist of INEOS RAS, Director of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.2.126.131
Получено: 10.03.2020 г.
В работе представлена информация о бактерии Brevibacillus laterosporus, способной образовывать белковые кристаллы, токсичные для некоторых насекомых, что позволяет рассматривать данные кристаллы безопасным и экологичным средством для борьбы с москитами. Исследована тонкая структура белковых кристаллов, приведены экспериментальные данные о полученных изображениях методом электронной микроскопии.
The article provides information about bacterium Brevibacillus laterosporus capable to form protein crystals, toxic to some insects, which allows us to consider these crystals as safe and environmentally friendly product in the fight against mosquitoes. A fine structure of protein crystals was studied and experimental data of the electron microscopy images were obtained.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в связи с распространенностью заболеваний, передающихся с помощью двукрылых насекомых, особое внимание уделяется биологическим методам борьбы с использованием энтомопатогенных бактерий, главным образом, Bac. thuringiensis (Вt). Основной вклад в развитие инфекционного процесса у насекомых при заражении Bt вносит белковый кристаллический δ-эндотоксин, синтезирующийся в процессе споруляции [1].
Белковые кристаллы эндотоксина образуются одновременно со спорами по одному, реже по два в каждой бактериальной клетке. Они токсичны для насекомых отрядов чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых.
Способность к кристаллообразованию у бактерий Brevibacillus laterosporus (Bl) до недавнего времени не была установлена. Бациллы Bl, в отличие от Bt, относятся к малоизученным энтомопатогенным бактериям. Их особенность в наличии каноэвидного включения, прикрепленного к споре.
Ранее нами были получены и охарактеризованы штаммы Bl, способные образовывать параспоральные кристаллы [2]. У исследованных штаммов Bl удалось обнаружить кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам, подобные тем, что описаны для энтомопатогенных бактерий Bt и B. sphaericus [3]. Кристаллы Bl обладают москитоцидными свойствами (токсичны для двукрылых), что важно в связи с возможностью их практического использования в случае развития устойчивости у личинок комаров к имеющимся инсектицидным препаратам на основе Вt [4]. Кристаллы Bl мало исследованы. Их сохранение в окружающей среде и проявление токсичности в организме хозяина зависят от физико-химических свойств, обусловленных их структурной организацией.
Различными микроскопическими методами ранее изучались споры и кристаллы нативных клеток B. laterosporus. С помощью атомно-силовой микроскопии получено трехмерное изображение спор [6]. Вид нативного каноэ дает возможность оценить его позицию по отношению собственно к споре. Однако кристаллы были недостаточно охарактеризованными. В настоящей работе получены данные об ультраструктурной организации кристаллов B. laterosporus.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы Bl были получены из лабораторной коллекции ВНИИ Генетика (Bl 16-92) и коллекции Института Пастера (Париж) от д-ра Lecadet (Lat 006). Штаммы выращивали на агаризованной среде NBY в течение 72 ч при 30 °С.
Электронная микроскопия. Споры и кристаллы смывали с агара, суспендировали, промывали в дистиллированной воде и исследовали методами ультратонких срезов и негативного контрастирования [2]. Суспензию спор и кристаллов для изучения методом негативного контрастирования наносили на сетки, покрытые углеродной пленкой и окрашивали контрастером фосфорно-вольфрамовой кислоты NANOWtm. Структура образцов изучена с помощью электронных микроскопов JEM-100B и LEO912AB (Zeiss). Параметры решетки кристалла BL 16-92 были определены по полученной дифракционной картине с помощью просвечивающего электронного микроскопа LEO912AB (Zeiss).
Обработка изображения проведена в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" (Центр перспективных технологий, РФ) [7, 8, 9, 10].
РЕЗУЛЬТАТЫ
У штаммов Bl 16-92, Lat 006 были обнаружены кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам, На рис.1a, b и рис.2a, b представлены данные, полученные при изучении ультратонких срезов этих штаммов. Кристаллы хорошо видны на срезах спорулирующих клеток. У штамма Bl 16-92 кристаллы, в основном, имеют ромбовидную форму (рис.1a, b). У штамма Lat 006 кристаллы имеют кубическую форму (рис.2a) или вытянутую форму с закругленными концами (рис.2b). Кристаллы окружены сетчатой оболочкой равномерной толщины, особенно хорошо видной у штамма Bl 16-92 (рис.1a).
При негативном контрастировании у штамма Bl 16-92 также видны ромбические кристаллы с четко очерченными углами размером, в основном, 0,4 × 0,3 мкм. Штамм Lat 006 имеет прямоугольные кристаллические включения размером 0,2 × 0,7 мкм или квадратные со сглаженными углами кристаллы размером 0,4 × 0,4 мкм и меньше. Встречаются кристаллы менее правильной формы.
Кристаллы штамма Lat 006 отличаются от кристаллов штамма Bl 16-92 не только формой, но и большей электронной плотностью. Однако они сходны с кристаллами Bl 16-92 наличием оболочки, изолирующей их от воздействия факторов внешней среды.
При негативном контрастировании особенно четко выявляются электронно-плотные кристаллы Lat 006 (рис.3, 4, 5).
На поверхности белкового кристалла наблюдается периодическое упорядочение молекул. На рис.6 приведено характерное изображение фрагмента поверхности белкового кристалла, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии. Для кристалла характерна кубическая упаковка с периодом около 4,5 нм.
Для сравнения ранее нами исследовались инсектицидные кристаллы Bt var. galleriae методом негативного контрастирования, токсичных для чешуекрылых насекомых, и была обнаружена параллельная исчерченность поверхности кристаллов с периодом около 20 нм [5]. Этим методом были изучены и кристаллы Bt var. israelensis, обладающие москитоцидной активностью. При электронной микроскопии этих кристаллов, негативно окрашенных 2%-ным молибдатом аммония, на поверхности наблюдали решетку из частых поперечных линий с периодом 7 нм. У кристаллов, токсичных для двукрылых, не удавалось выявить исчерченность, характерную для кристаллов, токсичных для чешуекрылых.
Проекционное изображение одиночного кристалла клеток B. laterosporus Lat 006, полученное на просвечивающем электронном микроскопе LEO 912AB, представлено на рис.7.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе получены данные об ультраструктурной организации кристаллов B. laterosporus. Их структура оказалась сходной по размерам кристаллической решетки с кристаллами Bt var. israelensis, токсичными для личинок комаров. Независимо от принадлежности к виду бацилл особенности строения кристаллов вероятно в большей степени определяются свойствами объекта их инсектицидного действия.
Характерный размер упаковки белков в кристаллах B. laterosporus – около 4,5 нм. Размеры кристаллов варьируются в пределах 50–700 нм. При этом кристалл кубической формы с гранью в 250 нм содержит в себе около 170 тыс. белковых субъединиц.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H. Bac. thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. Vol. 62. P. 775–806.
Smirnova T.A., Minenkova I.B., Orlova M.V., Azizbekyan R.R., Lecadet M. The crystal-forming strains of bacillus laterosporus // Research in Microbiology. 1996. Vol. 147. No. 5. P. 343–350.
Charles J-F., Nielsen-LeRoux C. and Delecluse A. Bacillus sphaericus toxins: molecular biology and mode of action // Annu. Rev. Entomol. 1996. Vol. 41. P. 451–472.
Orlova M.V., Smirnova T.A., Azizbekyan R.R., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y. Insecticidal activity of bacillus laterosporus. Applied and Environmental Microbiology. 1998. Vol. 64. No. 7. P. 2723–2725.
Smirnova T.A., Mikhailov A.M., Tiurin V.S., Azizbekian R.R. Ultrastructure of the bacterial spores and crystals of various Bacillus huringiensis serotypes // Mikrobiologiya. 1984. No. 53. P. 455–462.
Zubasheva M., Sagitova A., Smirnov Yu., Smirnova T., Azizbekyan R., Zhukhovitsky V., Yaminsky I. Ultrastructural analysis of Brevibacillus laterosporus bacterial cells using electron and atomic force microscopy // Nanoindustry. 2017. No. 2 (72). P. 74–78.
Yaminsky I., Filonov A., Sinitsyna O., Meshkov G. FemtoScan Online software // Nanoindustry. 2016. No. 2(64). P. 42–46.
Akhmetova A., Yaminsky I. 20 years since FemtoScan shows atoms // Nanoindustry. 2017. No. 2(72). P. 88–89.
Filonov A., Yaminsky I., Akhmetova A., Meshkov G. FemtoScan Online. Why? // Nanoindustry. 2018. Vol. 11. No. 5(84). P. 336–342.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online Software and Visualization of Nano-Objects in High-Resolution Microscopy // Nanoindustry. 2018. Vol. 11. No. 6 (85). P. 414–416.
Отзывы читателей
