eng
Выпуск #3-4/2020
И.В.Яминский, А.И.Ахметова, М.А.Павлова
Раннее обнаружение вирусных инфекций с использованием твердотельных пьезокерамических биосенсоров
Раннее обнаружение вирусных инфекций с использованием твердотельных пьезокерамических биосенсоров
Просмотры: 2497
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.3-4.188.195
Раннее обнаружение возбудителей вирусных заболеваний является фундаментальной задачей современной биомедицины. Эффективное решение этой задачи особенно востребовано в условиях возникшей в настоящее время мировой коронавирусной пандемии. Вместе с тем и по ее окончании разработка новых и каждый раз более эффективных биосенсоров на вирусные инфекции будет продолжаться интенсивным образом. Вирусы – это попутчики человека в прошлом, настоящем и будущем.
Раннее обнаружение возбудителей вирусных заболеваний является фундаментальной задачей современной биомедицины. Эффективное решение этой задачи особенно востребовано в условиях возникшей в настоящее время мировой коронавирусной пандемии. Вместе с тем и по ее окончании разработка новых и каждый раз более эффективных биосенсоров на вирусные инфекции будет продолжаться интенсивным образом. Вирусы – это попутчики человека в прошлом, настоящем и будущем.
Теги: biochips biosensors influenza a virus sars-cov-2 coronavirus scanning probe microscopy tick-borne encephalitis virus биосенсоры биочипы вирус гриппа а вирус клещевого энцефалита коронавирус sars-cov-2 сканирующая зондовая микроскопия
РАННЕЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТВЕРДОТЕЛЬНЫХ ПЬЕЗОКЕРАМИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ
EARLY DETECTION OF VIRAL INFECTIONS USING SOLID-STATE PIEZOELECTRIC CERAMIC BIOSENSORS
И.В.Яминский1, 2, 3, 4, д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотрудник ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0001-6363-8202), М.А.Павлова1, студентка, (ORCID: 0000-0002-4426-0838) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doctor of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Specialist of INEOS RAS, А.I.Аkhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, M.A.Pavlova1, Student
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.3-4.188.195
Получено: 19.05.2020 г.
Раннее обнаружение возбудителей вирусных заболеваний является фундаментальной задачей современной биомедицины. Эффективное решение этой задачи особенно востребовано в условиях возникшей в настоящее время мировой коронавирусной пандемии. Вместе с тем и по ее окончании разработка новых и каждый раз более эффективных биосенсоров на вирусные инфекции будет продолжаться интенсивным образом. Вирусы – это попутчики человека в прошлом, настоящем и будущем.
The early detection of viral pathogens is a fundamental goal of modern biomedicine. An effective solution of this problem is especially in demand in the context of the current global coronavirus pandemic. At the same time, and upon its completion, the development of new and each time more effective biosensors for viral infections will continue in an intensive manner. Viruses are human companions in the past, present and future.
В задаче обнаружения вирусов есть два важных аспекта. Первый аспект связан с обнаружением в окружающей среде возбудителя заболеваний в момент, когда инфицирование еще не произошло. Именно это является жизненно важной целью предупредительной медицины. При этом предупреждение заболевания является существенно менее затратным процессом, нежели чем последующее лечение возможной болезни. Второй аспект предполагает обнаружение вирусных агентов после случившегося заражения.
Подходы для этих двух случаев имеют свои особенности. При раннем предупреждении вирусного заболевания основной мишенью поиска становятся сами вирусные частицы в воздушных и/или жидких средах. Задачами становятся поиск, концентрирование и идентификация вирусов. Для этого регистрирующее устройство должно быть компактным, мобильным, носимым, энергоэффективным, высокочувствительным и избирательным к мишеням, простым в обращении, использовании и обслуживании, выдающим результат анализа за короткий промежуток времени. Цена биосенсора тоже является не последним критерием. Низкая стоимость обеспечивает его доступность и массовое применение.
При необходимости выявления причины заболевания варианты обнаруживаемых мишеней могут быть различными: как сами вирусные частицы (аналогично первому случаю), так и антитела к вирусу, вырабатываемые иммунной системой зараженного человека. Выявление повреждений, вызванных вирусом, также может быть альтернативным способом определения заболевания. Например, при коронавирусных инфекциях надежным методом диагностики является компьютерная томография, позволяющая увидеть повреждение тканей легких или других органов. Наличие биосенсора или устройства, которые способны регистрировать характер воздействия на ткани человека, также является в высшей степени востребованной потребностью современной медицины.
Хотя существует большое количество подходов к созданию компактных и мобильных биосенсоров без использования меток, лишь немногие технологии обещают достичь уровня детектирования одного вируса в жидкой среде. Среди таких технологий следует упомянуть следующие: высокодобротные оптические резонаторы [1–3], сенсоры на основе плазмонного резонанса [4], наномеханические резонаторы и нанопроволочные биосенсоры [5].
Среди электромеханических биосенсоров широко используется технология кварцевого микровзвешивания [6]. В этих сенсорах проводится измерение резонансной частоты кварцевой пластинки при изменении связанной массы. Кварцевая пластинка одной стороной обращена в жидкость и совершает сдвиговые колебания. В результате этого чувствительность к изменению упругих свойств поверхностной пленки незначительна, поскольку при измерении пленка не претерпевает циклов растяжения-сжатия достаточного уровня. Однако часто оказывается, что именно изменение упругих свойств пленки "зонд-мишень" играет определяющую роль в формировании регистрируемого сигнала. При всех своих плюсах в методе кварцевого микровзвешивания не удается достичь миниатюризации прибора.
Увеличение чувствительности на шесть порядков по сравнению с лучшими экземплярами коммерческих кварцевых весов достигается в кантилеверном биосенсоре с внутренним каналом и общей массой около 100 нг [7]. Кантилеверные биосенсоры [8, 9] являются высокочувствительной платформой для обнаружения вирусов. В лабораторных экспериментах достигнута чувствительность по обнаружению единичного вируса [10] и даже одного атома [11]. Недостатком кантилеверных систем являются технологические сложности в реализации массового производства. Предлагаемое решение при сохранении высокой чувствительности предполагает использование планарной технологии изготовления биочипа. Это дает существенные преимущества при массовом тиражировании. При этом синтез рецепторной поверхности может происходить сразу на большой плоскости заготовки с последующим ее разделением на отдельные микрочипы.
Оптические биосенсоры представляют собой широко распространенный тип биосенсоров. Оптический сигнал, который обладает высокой чувствительностью, устойчивостью к внешним помехам, стабильностью и низким уровнем шума, является преимуществом по сравнению с другими физическими сигналами. Однако наличие дифракционного предела не позволяет оптическим способом снимать сигнал с нанометровой области для обнаружения единичных белков или антител. Недавно группой американских ученых был разработан оригинальный фемтосекундный адаптивный спектроскопический метод с улучшенным разрешением благодаря когерентной антистоксовой спектроскопии комбинационного рассеяния (FASTER CARS), использующей усиление сигнала с помощью зонда (tip enhanced Raman spectroscopy). В результате удается обнаружить единичные вирусные частицы [12].
Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и атомно-силовая микроскопия позволяют успешно визуализировать единичные вирусные частицы. При этом различные приемы по контрастированию дают возможность в ПЭМ видеть структурные элементы оболочки вируса. При всех достоинствах эти методы вряд ли удастся сделать компактными, мобильными и недорогими. Хотя в области атомно-силовой микроскопии существуют варианты приборов (без учета габаритов электроники) миллиметрового размера, но они остаются по-прежнему сложными и дорогостоящими.
Электрохимические биосенсоры основаны на вступлении в электрохимическую реакцию биологического материала с аналитом [13]. Основные категории электрохимических биосенсоров – потенциометрические, амперометрические и импедиметрические преобразователи. Электрохимические биосенсоры имеют ряд преимуществ в части чувствительности и селективности. Они могут быть мобильными и недорогими. Существует, например, много вариантов коммерческих амперометрических биосенсоров. Биосенсоры по определению уровня глюкозы наиболее известны и общедоступны, например: SIRE P201 (Chemel AB, Лунд, Швеция), система мониторинга уровня глюкозы в крови FreeStyle Freedom, Precision Xtra (Abbot Diabetes Care, Аламеда, Калифорния, США) и GlucoWatch Biographer (Cygnus, Редвуд Сити, Калифорния, США). Устройство Midas Pro (Biosensori SpA, Милан, Италия) широко используется для анализа поверхностных вод.
В настоящее время ПЦР-анализ с обратной транскрипцией на SARS-CoV-2 можно провести только в лабораторных условиях. Для его выполнения требуется набор реактивов и лабораторное оборудование. Тест лучших систем способен обнаружить 0,3–3 копии вирусной РНК в микролитре (0,001 мл). Время тестирования – несколько часов. Сейчас стремятся дополнительно сократить время анализа.
Пьезокерамические биосенсоры появились не так давно, но они уже продемонстрировали высокую чувствительность при обнаружении рецептора фактора эпидермального роста (Her2) [14], вируса (WSSV) растений [15], бактериальных спор (Bacillus anthracis) [16], ДНК [17] и вируса гриппа А [18].
В нашей работе по разработке пьезокерамического биосенсора для обнаружения вирусных инфекций мы регистрируем связывание "зонд-мишень" по изменению характеристик колебаний биочипа. Данное решение не предполагает использование дополнительных меток и химических реагентов. Избирательная сенсорная система полностью расположена на поверхности биочипа, поэтому исчезает необходимость использования дополнительных химических и биологических реагентов: ДНК-праймеров, TAG-полимеразы, различных меток и др., в отличие от ПЦР-диагностики и иммуноферментного анализа.
В качестве мишеней при апробации биосенсора нами выбраны вирус гриппа А (рис.1), вирус клещевого энцефалита (рис.2) и коронавирус. Выбор мишеней обусловлен в первую очередь насущной потребностью в активном противостоянии этим вирусным инфекциям. Вирус гриппа А является постоянным сезонным заболеванием, вирус клещевого энцефалита за последний короткий срок стал широко распространяться по территории Российской Федерации, коронавирус SARC-CoV-2 является причиной современной пандемии.
Предлагаемое решение биосенсора состоит из пьезокерамического биочипа в виде диска с диаметром 0,1–3 мм. Симметричная трехэлектродная конструкция исключает влияние двойного электрического слоя и паразитных диффузионных процессов на поверхности биочипа (Патент на изобретение № 2636048, Биосенсорное устройство для обнаружения биологических микро- и нанообъектов, 2017 г.). В этой конструкции биочипа потенциал подается на центральный электрод, при этом внешние электроды, обращенные к раствору, можно заземлять или держать под потенциалом раствора. При этом, в отличие от известных конструкций, отпадает необходимость в дополнительном слое, изолирующем внешние электроды. Применение периодического и импульсного режимов возбуждения колебаний позволяет за счет использования оригинальных алгоритмов достигать высокой чувствительности при обнаружении вируса гриппа А [18].
Измерительная электронная система реализовывается с использованием технологий программируемой логической интегральной схемы FPGA (Field-Programmable Gate Array) или ее дальнейшего развития в виде ASIC (Application Specific Integrated Circuit). Планируется адаптация имеющейся электронной системы сбора информации сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан" для проведения как резонансных измерений, так и обработки электрохимических сигналов. Сигнал с пьезокерамического биосенсора приходит на частоте механического резонанса биочипа, как правило, это высокочастотный диапазон от сотен кГц до сотен МГц. Сигнал с электрохимического биосенсора расположен в диапазоне существенно более низких частот. Это позволяет синхронно регистрировать сигналы от электрохимического и пьезокерамического биосенсоров с помощью одной электроники. Более того, можно объединить два биосенсора – пьезокерамический и электрохимический – в одном биосенсоре, при этом с одного и того же биочипа будут поступать сразу два сигнала.
Жидкостная система может быть выполнена как по микрофлюидной технологии, так и с использованием резервуара миллиметровых размеров. В качестве зондов предполагается использование антител, аптамеров и/или синтетических рецепторов. В случае коронавируса SARC-CoV-2 может служить белок ACE2 эпителиальных клеток, к которому присоединяется вирус при инфицировании. При этом константа связывания имеет необычно высокое значение. При тестировании возможно использовать рекомбинантный водорастворимый белок ACE2, доступный на рынке биореагентов.
Предварительно рассчитанное значение чувствительности биосенсора на SARC-CoV-2 составляет 1–100 вирусных частиц в зависимости от размера площади биочипа (0,1–3 мм). Для вируса гриппа А и вируса клещевого энцефалита чувствительность чуть хуже, поскольку константа связывания у имеющихся в настоящее время рецепторов в 3–10 раз меньше.
С помощью биосенсора предлагаемой конструкции возможно регистрировать не только акт связывания, но и момент отрыва вирусной частицы при увеличении амплитуды механических колебаний биочипа до пороговых значений, когда механическая энергия колеблющейся вирусной частицы становится больше энергии связи. В момент отрыва возникает сигнал отрыва, зарегистрировать который позволяет электронная измерительная система. Таким образом, биосенсор сможет регистрировать как связывание вируса, так и его отрыв.
Следует заметить, что неспецифическое связывание в жидкости при наличии различных примесей, осаждаемых на поверхности биочипа, не приводит к существенному изменению механической жесткости поверхностного слоя и не влияет на сигнал отрыва частицы при большой амплитуде колебаний.
Последующая характеризация вируса при достаточно большом его количестве может проводиться методами хроматографии, просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии. Для обработки данных целесообразно использовать разработанное нами программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [19].
В отличие от кварцевого микровзвешивания, в биочипе возбуждаются продольные колебания, которые приводят к растяжению/сжатию сенсорной пленки с прикрепленными вирусными частицами или биомакромолекулами. Измерение жесткости пленки оказывается в 300–1000 раз более чувствительным, чем просто определение прикрепленной массы (как в методе кварцевого микровзвешивания). Любопытно, но этот экспериментальный факт заметил еще в 18 веке Бенджамин Франклин. Путешествуя из Нового в Старый Свет на китобойном судне, Бенджамин Франклин обратил внимание, что во время шторма капитан приказал вылить в море бочку китового жира. После этого волны вблизи корабля успокоились. Современное объяснение этому эффекту довольно простое: на поверхности воды образуется монослойная пленка жира. На ее сжатие и расширение во время шторма затрачивается большая механическая энергия, в результате происходит затухание волн. А пленка жира преобразует механическую энергию в тепловую энергию, передавая ее морской волне. Удивительно, но расчет показывает, что пленка толщиной в нанометры успокаивает метровые волны на воде.
Создание "идеального" биосенсора на вирусные инфекции – задача сколь благородная, столь и сложная. На этом пути новые идеи и решения будут приводить к постоянному прогрессу. Объединение усилий специалистов из разных областей знаний, бесспорно, будет способствовать продвижению вперед. На нашем пути мы будем только рады попутчикам.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yoshie T., Tang L.L., Su S.Y. Optical microcavity: sensing down to single molecules and atoms. Sensors 2011;11:1972–91.
Vollmer F., Yan L. Label-free detection with high-Q microcavities: a review of mechanisms for integrated devices. Nanophotonics 1 (2012): 267–291 © 2012 Science Wise Publishing & De Gruyter, Berlin, Boston. DOI 10.1515/nanoph-2012-0021. https://www.academia.edu/7757258/Label-free_detection_with_high-Q_microcavities.
Gil-Santos E., Ruz J.J., Malvar O. et al. Optomechanical detection of vibration modes of a single bacterium. Nat. Nanotechnol. (2020). https://doi.org/10.1038/s41565-020-0672-y
Anker J.N., Hall W.P., Lyandres O., Shah N.C., Zhao J., VanDuyne R.P. Biosensing with plasmonic nanosensors. Nat Mater 2008;7:442–53.
Patolsky F., Zheng G.F, Hayden O., Lakadamyali M., Zhuang X.W., Lieber C.M. Electrical detection of single viruses. ProcNatl Acad Sci USA 2004;101:14017–22.
Dixon M.C. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring: enabling realtime characterization of biological materials and their interactions. Journal of biomolecular techniques: JBT 19, 151 (2008).
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M., Shen W., Carlson G., Foster J.S., Babcock K., Manalis S.R. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature 446, 1066–1069 (26 April 2007).
Arlett J., Myers E., Roukes M. Comparative advantages of mechanical biosensors. Nature nanotechnology 6, 203–215 (2011).
Boisen A., Dohn S., Keller S.S., Schmid S., Tenje M. Cantilever-like micromechanical sensors. Reports on Progress in Physics 74, 036101 (2011).
Gupta A., Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness // Appl. Phys. Lett. 2004. V. 84. No. 11. PP. 1976–1978.
Jensen K., Kwanpyo K., Zettl A. An atomic-resolution nanomechanical mass sensor. Nature Nanotechnology 3, 533–537 (2008).
Deckert V., Deckert-Gaudig T., Cialla D., Popp J., Zell R., Sokolov A.V., Yi Z., Scully M.O. // Laser Spectroscopic Technique for Direct Identification of a Single Virus I: FASTER CARS, 17 March 2020, ArXiV ID: 2003.07951.
Iqbal M.A., Gupta S.G., Hussaini S.S. A Review on Electrochemical Biosensors: Principles and Applications // Advances in Bioresearch, V. 3[4], December 2012, P. 158–163.
Loo L., Capobianco J.A., Wu W., Gao X., Shih W.Y., Shih W.H., Pourrezaei K., Robinson M.K., Adams G.P. // Anal. Chem. 83, 3392, (2011).
Capobianco J.A., Shih W.H., Leu J.H., Lo G.C., Shih W.Y. // Biosens. Bioelectron. 26, 964 (2010).
McGovern J.P., Shih W.Y., Rest R., Purohit M., Pandya Y., Shih W.H. // Analyst 133, 649 (2008).
Wu W., Kirimli C.E., Shih W., Shih W.Y. Biosens. Bioelectron. 43, 391 (2013).
Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Kolesov D.V., Kiselev G.A., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Label-free sensitive detection of influenza virus using PZT discs with a synthetic sialylglycopolymer receptor layer. Royal Society Open Science, 6:190255, 2019. https://doi.org/10.1098/rsos.190255
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Software FemtoScan Online in solving problems of biology and medicine // Medicine and High Technologies. 2019. No. 1. P. 16–22.
EARLY DETECTION OF VIRAL INFECTIONS USING SOLID-STATE PIEZOELECTRIC CERAMIC BIOSENSORS
И.В.Яминский1, 2, 3, 4, д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотрудник ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0001-6363-8202), М.А.Павлова1, студентка, (ORCID: 0000-0002-4426-0838) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doctor of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Specialist of INEOS RAS, А.I.Аkhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, M.A.Pavlova1, Student
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.3-4.188.195
Получено: 19.05.2020 г.
Раннее обнаружение возбудителей вирусных заболеваний является фундаментальной задачей современной биомедицины. Эффективное решение этой задачи особенно востребовано в условиях возникшей в настоящее время мировой коронавирусной пандемии. Вместе с тем и по ее окончании разработка новых и каждый раз более эффективных биосенсоров на вирусные инфекции будет продолжаться интенсивным образом. Вирусы – это попутчики человека в прошлом, настоящем и будущем.
The early detection of viral pathogens is a fundamental goal of modern biomedicine. An effective solution of this problem is especially in demand in the context of the current global coronavirus pandemic. At the same time, and upon its completion, the development of new and each time more effective biosensors for viral infections will continue in an intensive manner. Viruses are human companions in the past, present and future.
В задаче обнаружения вирусов есть два важных аспекта. Первый аспект связан с обнаружением в окружающей среде возбудителя заболеваний в момент, когда инфицирование еще не произошло. Именно это является жизненно важной целью предупредительной медицины. При этом предупреждение заболевания является существенно менее затратным процессом, нежели чем последующее лечение возможной болезни. Второй аспект предполагает обнаружение вирусных агентов после случившегося заражения.
Подходы для этих двух случаев имеют свои особенности. При раннем предупреждении вирусного заболевания основной мишенью поиска становятся сами вирусные частицы в воздушных и/или жидких средах. Задачами становятся поиск, концентрирование и идентификация вирусов. Для этого регистрирующее устройство должно быть компактным, мобильным, носимым, энергоэффективным, высокочувствительным и избирательным к мишеням, простым в обращении, использовании и обслуживании, выдающим результат анализа за короткий промежуток времени. Цена биосенсора тоже является не последним критерием. Низкая стоимость обеспечивает его доступность и массовое применение.
При необходимости выявления причины заболевания варианты обнаруживаемых мишеней могут быть различными: как сами вирусные частицы (аналогично первому случаю), так и антитела к вирусу, вырабатываемые иммунной системой зараженного человека. Выявление повреждений, вызванных вирусом, также может быть альтернативным способом определения заболевания. Например, при коронавирусных инфекциях надежным методом диагностики является компьютерная томография, позволяющая увидеть повреждение тканей легких или других органов. Наличие биосенсора или устройства, которые способны регистрировать характер воздействия на ткани человека, также является в высшей степени востребованной потребностью современной медицины.
Хотя существует большое количество подходов к созданию компактных и мобильных биосенсоров без использования меток, лишь немногие технологии обещают достичь уровня детектирования одного вируса в жидкой среде. Среди таких технологий следует упомянуть следующие: высокодобротные оптические резонаторы [1–3], сенсоры на основе плазмонного резонанса [4], наномеханические резонаторы и нанопроволочные биосенсоры [5].
Среди электромеханических биосенсоров широко используется технология кварцевого микровзвешивания [6]. В этих сенсорах проводится измерение резонансной частоты кварцевой пластинки при изменении связанной массы. Кварцевая пластинка одной стороной обращена в жидкость и совершает сдвиговые колебания. В результате этого чувствительность к изменению упругих свойств поверхностной пленки незначительна, поскольку при измерении пленка не претерпевает циклов растяжения-сжатия достаточного уровня. Однако часто оказывается, что именно изменение упругих свойств пленки "зонд-мишень" играет определяющую роль в формировании регистрируемого сигнала. При всех своих плюсах в методе кварцевого микровзвешивания не удается достичь миниатюризации прибора.
Увеличение чувствительности на шесть порядков по сравнению с лучшими экземплярами коммерческих кварцевых весов достигается в кантилеверном биосенсоре с внутренним каналом и общей массой около 100 нг [7]. Кантилеверные биосенсоры [8, 9] являются высокочувствительной платформой для обнаружения вирусов. В лабораторных экспериментах достигнута чувствительность по обнаружению единичного вируса [10] и даже одного атома [11]. Недостатком кантилеверных систем являются технологические сложности в реализации массового производства. Предлагаемое решение при сохранении высокой чувствительности предполагает использование планарной технологии изготовления биочипа. Это дает существенные преимущества при массовом тиражировании. При этом синтез рецепторной поверхности может происходить сразу на большой плоскости заготовки с последующим ее разделением на отдельные микрочипы.
Оптические биосенсоры представляют собой широко распространенный тип биосенсоров. Оптический сигнал, который обладает высокой чувствительностью, устойчивостью к внешним помехам, стабильностью и низким уровнем шума, является преимуществом по сравнению с другими физическими сигналами. Однако наличие дифракционного предела не позволяет оптическим способом снимать сигнал с нанометровой области для обнаружения единичных белков или антител. Недавно группой американских ученых был разработан оригинальный фемтосекундный адаптивный спектроскопический метод с улучшенным разрешением благодаря когерентной антистоксовой спектроскопии комбинационного рассеяния (FASTER CARS), использующей усиление сигнала с помощью зонда (tip enhanced Raman spectroscopy). В результате удается обнаружить единичные вирусные частицы [12].
Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и атомно-силовая микроскопия позволяют успешно визуализировать единичные вирусные частицы. При этом различные приемы по контрастированию дают возможность в ПЭМ видеть структурные элементы оболочки вируса. При всех достоинствах эти методы вряд ли удастся сделать компактными, мобильными и недорогими. Хотя в области атомно-силовой микроскопии существуют варианты приборов (без учета габаритов электроники) миллиметрового размера, но они остаются по-прежнему сложными и дорогостоящими.
Электрохимические биосенсоры основаны на вступлении в электрохимическую реакцию биологического материала с аналитом [13]. Основные категории электрохимических биосенсоров – потенциометрические, амперометрические и импедиметрические преобразователи. Электрохимические биосенсоры имеют ряд преимуществ в части чувствительности и селективности. Они могут быть мобильными и недорогими. Существует, например, много вариантов коммерческих амперометрических биосенсоров. Биосенсоры по определению уровня глюкозы наиболее известны и общедоступны, например: SIRE P201 (Chemel AB, Лунд, Швеция), система мониторинга уровня глюкозы в крови FreeStyle Freedom, Precision Xtra (Abbot Diabetes Care, Аламеда, Калифорния, США) и GlucoWatch Biographer (Cygnus, Редвуд Сити, Калифорния, США). Устройство Midas Pro (Biosensori SpA, Милан, Италия) широко используется для анализа поверхностных вод.
В настоящее время ПЦР-анализ с обратной транскрипцией на SARS-CoV-2 можно провести только в лабораторных условиях. Для его выполнения требуется набор реактивов и лабораторное оборудование. Тест лучших систем способен обнаружить 0,3–3 копии вирусной РНК в микролитре (0,001 мл). Время тестирования – несколько часов. Сейчас стремятся дополнительно сократить время анализа.
Пьезокерамические биосенсоры появились не так давно, но они уже продемонстрировали высокую чувствительность при обнаружении рецептора фактора эпидермального роста (Her2) [14], вируса (WSSV) растений [15], бактериальных спор (Bacillus anthracis) [16], ДНК [17] и вируса гриппа А [18].
В нашей работе по разработке пьезокерамического биосенсора для обнаружения вирусных инфекций мы регистрируем связывание "зонд-мишень" по изменению характеристик колебаний биочипа. Данное решение не предполагает использование дополнительных меток и химических реагентов. Избирательная сенсорная система полностью расположена на поверхности биочипа, поэтому исчезает необходимость использования дополнительных химических и биологических реагентов: ДНК-праймеров, TAG-полимеразы, различных меток и др., в отличие от ПЦР-диагностики и иммуноферментного анализа.
В качестве мишеней при апробации биосенсора нами выбраны вирус гриппа А (рис.1), вирус клещевого энцефалита (рис.2) и коронавирус. Выбор мишеней обусловлен в первую очередь насущной потребностью в активном противостоянии этим вирусным инфекциям. Вирус гриппа А является постоянным сезонным заболеванием, вирус клещевого энцефалита за последний короткий срок стал широко распространяться по территории Российской Федерации, коронавирус SARC-CoV-2 является причиной современной пандемии.
Предлагаемое решение биосенсора состоит из пьезокерамического биочипа в виде диска с диаметром 0,1–3 мм. Симметричная трехэлектродная конструкция исключает влияние двойного электрического слоя и паразитных диффузионных процессов на поверхности биочипа (Патент на изобретение № 2636048, Биосенсорное устройство для обнаружения биологических микро- и нанообъектов, 2017 г.). В этой конструкции биочипа потенциал подается на центральный электрод, при этом внешние электроды, обращенные к раствору, можно заземлять или держать под потенциалом раствора. При этом, в отличие от известных конструкций, отпадает необходимость в дополнительном слое, изолирующем внешние электроды. Применение периодического и импульсного режимов возбуждения колебаний позволяет за счет использования оригинальных алгоритмов достигать высокой чувствительности при обнаружении вируса гриппа А [18].
Измерительная электронная система реализовывается с использованием технологий программируемой логической интегральной схемы FPGA (Field-Programmable Gate Array) или ее дальнейшего развития в виде ASIC (Application Specific Integrated Circuit). Планируется адаптация имеющейся электронной системы сбора информации сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан" для проведения как резонансных измерений, так и обработки электрохимических сигналов. Сигнал с пьезокерамического биосенсора приходит на частоте механического резонанса биочипа, как правило, это высокочастотный диапазон от сотен кГц до сотен МГц. Сигнал с электрохимического биосенсора расположен в диапазоне существенно более низких частот. Это позволяет синхронно регистрировать сигналы от электрохимического и пьезокерамического биосенсоров с помощью одной электроники. Более того, можно объединить два биосенсора – пьезокерамический и электрохимический – в одном биосенсоре, при этом с одного и того же биочипа будут поступать сразу два сигнала.
Жидкостная система может быть выполнена как по микрофлюидной технологии, так и с использованием резервуара миллиметровых размеров. В качестве зондов предполагается использование антител, аптамеров и/или синтетических рецепторов. В случае коронавируса SARC-CoV-2 может служить белок ACE2 эпителиальных клеток, к которому присоединяется вирус при инфицировании. При этом константа связывания имеет необычно высокое значение. При тестировании возможно использовать рекомбинантный водорастворимый белок ACE2, доступный на рынке биореагентов.
Предварительно рассчитанное значение чувствительности биосенсора на SARC-CoV-2 составляет 1–100 вирусных частиц в зависимости от размера площади биочипа (0,1–3 мм). Для вируса гриппа А и вируса клещевого энцефалита чувствительность чуть хуже, поскольку константа связывания у имеющихся в настоящее время рецепторов в 3–10 раз меньше.
С помощью биосенсора предлагаемой конструкции возможно регистрировать не только акт связывания, но и момент отрыва вирусной частицы при увеличении амплитуды механических колебаний биочипа до пороговых значений, когда механическая энергия колеблющейся вирусной частицы становится больше энергии связи. В момент отрыва возникает сигнал отрыва, зарегистрировать который позволяет электронная измерительная система. Таким образом, биосенсор сможет регистрировать как связывание вируса, так и его отрыв.
Следует заметить, что неспецифическое связывание в жидкости при наличии различных примесей, осаждаемых на поверхности биочипа, не приводит к существенному изменению механической жесткости поверхностного слоя и не влияет на сигнал отрыва частицы при большой амплитуде колебаний.
Последующая характеризация вируса при достаточно большом его количестве может проводиться методами хроматографии, просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии. Для обработки данных целесообразно использовать разработанное нами программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [19].
В отличие от кварцевого микровзвешивания, в биочипе возбуждаются продольные колебания, которые приводят к растяжению/сжатию сенсорной пленки с прикрепленными вирусными частицами или биомакромолекулами. Измерение жесткости пленки оказывается в 300–1000 раз более чувствительным, чем просто определение прикрепленной массы (как в методе кварцевого микровзвешивания). Любопытно, но этот экспериментальный факт заметил еще в 18 веке Бенджамин Франклин. Путешествуя из Нового в Старый Свет на китобойном судне, Бенджамин Франклин обратил внимание, что во время шторма капитан приказал вылить в море бочку китового жира. После этого волны вблизи корабля успокоились. Современное объяснение этому эффекту довольно простое: на поверхности воды образуется монослойная пленка жира. На ее сжатие и расширение во время шторма затрачивается большая механическая энергия, в результате происходит затухание волн. А пленка жира преобразует механическую энергию в тепловую энергию, передавая ее морской волне. Удивительно, но расчет показывает, что пленка толщиной в нанометры успокаивает метровые волны на воде.
Создание "идеального" биосенсора на вирусные инфекции – задача сколь благородная, столь и сложная. На этом пути новые идеи и решения будут приводить к постоянному прогрессу. Объединение усилий специалистов из разных областей знаний, бесспорно, будет способствовать продвижению вперед. На нашем пути мы будем только рады попутчикам.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yoshie T., Tang L.L., Su S.Y. Optical microcavity: sensing down to single molecules and atoms. Sensors 2011;11:1972–91.
Vollmer F., Yan L. Label-free detection with high-Q microcavities: a review of mechanisms for integrated devices. Nanophotonics 1 (2012): 267–291 © 2012 Science Wise Publishing & De Gruyter, Berlin, Boston. DOI 10.1515/nanoph-2012-0021. https://www.academia.edu/7757258/Label-free_detection_with_high-Q_microcavities.
Gil-Santos E., Ruz J.J., Malvar O. et al. Optomechanical detection of vibration modes of a single bacterium. Nat. Nanotechnol. (2020). https://doi.org/10.1038/s41565-020-0672-y
Anker J.N., Hall W.P., Lyandres O., Shah N.C., Zhao J., VanDuyne R.P. Biosensing with plasmonic nanosensors. Nat Mater 2008;7:442–53.
Patolsky F., Zheng G.F, Hayden O., Lakadamyali M., Zhuang X.W., Lieber C.M. Electrical detection of single viruses. ProcNatl Acad Sci USA 2004;101:14017–22.
Dixon M.C. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring: enabling realtime characterization of biological materials and their interactions. Journal of biomolecular techniques: JBT 19, 151 (2008).
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M., Shen W., Carlson G., Foster J.S., Babcock K., Manalis S.R. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature 446, 1066–1069 (26 April 2007).
Arlett J., Myers E., Roukes M. Comparative advantages of mechanical biosensors. Nature nanotechnology 6, 203–215 (2011).
Boisen A., Dohn S., Keller S.S., Schmid S., Tenje M. Cantilever-like micromechanical sensors. Reports on Progress in Physics 74, 036101 (2011).
Gupta A., Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness // Appl. Phys. Lett. 2004. V. 84. No. 11. PP. 1976–1978.
Jensen K., Kwanpyo K., Zettl A. An atomic-resolution nanomechanical mass sensor. Nature Nanotechnology 3, 533–537 (2008).
Deckert V., Deckert-Gaudig T., Cialla D., Popp J., Zell R., Sokolov A.V., Yi Z., Scully M.O. // Laser Spectroscopic Technique for Direct Identification of a Single Virus I: FASTER CARS, 17 March 2020, ArXiV ID: 2003.07951.
Iqbal M.A., Gupta S.G., Hussaini S.S. A Review on Electrochemical Biosensors: Principles and Applications // Advances in Bioresearch, V. 3[4], December 2012, P. 158–163.
Loo L., Capobianco J.A., Wu W., Gao X., Shih W.Y., Shih W.H., Pourrezaei K., Robinson M.K., Adams G.P. // Anal. Chem. 83, 3392, (2011).
Capobianco J.A., Shih W.H., Leu J.H., Lo G.C., Shih W.Y. // Biosens. Bioelectron. 26, 964 (2010).
McGovern J.P., Shih W.Y., Rest R., Purohit M., Pandya Y., Shih W.H. // Analyst 133, 649 (2008).
Wu W., Kirimli C.E., Shih W., Shih W.Y. Biosens. Bioelectron. 43, 391 (2013).
Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Kolesov D.V., Kiselev G.A., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Label-free sensitive detection of influenza virus using PZT discs with a synthetic sialylglycopolymer receptor layer. Royal Society Open Science, 6:190255, 2019. https://doi.org/10.1098/rsos.190255
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Software FemtoScan Online in solving problems of biology and medicine // Medicine and High Technologies. 2019. No. 1. P. 16–22.
Отзывы читателей
