eng
Выпуск #6/2020
И.В.Яминский, А.И.Ахметова
Сканирующая зондовая микроскопия в решении задач вирусологии
Сканирующая зондовая микроскопия в решении задач вирусологии
Просмотры: 2223
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.6.340.344
Сканирующая зондовая микроскопия позволяет получать трехмерную визуализацию вирусов в различных средах: в жидкости и на воздухе. Помимо трехмерной топографии, можно измерять такие свойства, как механическая жесткость, адгезия, склонность к кристаллизации, агрегация частиц на подложке и т. д. Характеристика вирусов животных и человека является предметом многочисленных исследований из-за их потенциального вреда для высших организмов.
Сканирующая зондовая микроскопия позволяет получать трехмерную визуализацию вирусов в различных средах: в жидкости и на воздухе. Помимо трехмерной топографии, можно измерять такие свойства, как механическая жесткость, адгезия, склонность к кристаллизации, агрегация частиц на подложке и т. д. Характеристика вирусов животных и человека является предметом многочисленных исследований из-за их потенциального вреда для высших организмов.
Теги: 3-d topography 3d-топография scanning probe microscopy virology вирусология сканирующая зондовая микроскопия
И.В.Яминский1, 2, 3, 4, д.ф.-м.н., проф. МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0002-5115-8030) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, 4, Doct. of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS, А.I.Аkhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.6.340.344
Получено: 29.09.2020 г.
Методы сканирующей зондовой микроскопии были применены для визуализации вирусов растений, животных и человека [1] вскоре после изобретения сканирующей туннельной микроскопии в 1982 году [2, 3] и атомно-силовой микроскопии [4] в 1986 году. С первых же попыток визуализации вирусов стало очевидно, что появился новый высокоинформативный инструмент, который можно использовать в фундаментальных и практических науках, включая вирусологию и медицину. До сих пор определенную уникальную информацию можно получить только с помощью методов сканирующей зондовой микроскопии. Эта информация включает экспериментальные данные о механических свойствах вируса: механической жесткости и стабильности, адгезионных свойствах, силе связывания.
Стоит отметить, что другие мощные методы, основанные на просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), не следует рассматривать как конкурирующие со сканирующей зондовой микроскопией в исследованиях окружающей среды. Методы просвечивающей микроскопии позволяют получать изображения вирусных частиц в вакууме, что прекрасно дополняет данные, полученные с помощью зондовой микроскопии.
Отличительной особенностью зондовой микроскопии от других методов является пробоподготовка. Она не требует специальных навыков. В зондовой микроскопии используются три вида подложек: слюда, графит и стекло. Слюда гидрофильна, что облегчает нанесение образцов с вирусом. Свежесколотый графит является гидрофобным. И у графита, и у слюды можно снять верхний слой, получив идеальную подложку для зондовой микроскопии. У графита высшего качества расстояние между террасами может достигать 10 мкм. Стекло используется гораздо реже, оно не такое равномерно плоское, как графит и слюда. Стекло обычно имеет волнообразный рельеф с амплитудой нанометрового размера. Наблюдаемая топография стекла может затруднить точное измерение размера вируса.
Адгезионную способность слюды и графита можно проиллюстрировать, исследуя вирус табачной мозаики. В зависимости от подложки одна и та же концентрация частиц в образце может различаться для графита и слюды [5].
Функционализированные подложки используются в сенсорных приложениях. В этом случае подложки могут быть покрыты антителами [6], аптамерами [7], синтетическими рецепторами [8, 9].
При подготовке образца с вирусными частицами желательно исключить попадание посторонних объектов, особенно затрудняют визуализацию осевшие частицы из буфера.
Для разбавления образца возможно использование дистиллированной воды: после нанесения суспензии на подложку и пролонгации образец можно промыть. Длительность пролонгации зависит от образца и может составлять от нескольких секунд до 30 мин.
Во время сканирования реальные размеры вирусных частиц могут отличаться. Иногда из-за взаимодействия вируса с подложкой высота может быть меньше реальной. Также высота частицы зависит от подложки: на графите вирус может быть выше, чем на слюде (разница наблюдаемых высот вируса табачной мозаики составляет около 1 нм). Из-за формы кончика кантилевера частицы могут выглядеть шире, чем они есть на самом деле. Это так называемый эффект уширения кантилевера [10]. Точный диаметр вируса можно наблюдать в кристаллической форме [11].
ПО ДЛЯ ОБРАБОТКИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
После сканирования необходимо обработать полученные результаты. Обработка изображений – еще одна высокохудожественная задача. От того, как обрабатывается изображение, сильно зависит интерпретация полученных результатов.
Большинство программных пакетов имеет встроенную службу геометрических измерений и преобразований, которая включает [12]:
Распознавание объектов одинаковой формы – одна из важных задач в зондовой микроскопии. Человеческий глаз быстро находит интересующую частицу определенной формы на изображении. Однако для автоматизации этого процесса необходимы четкие математические критерии. При анализе образца с гладкой поверхностью изображение имеет однородный фон, на котором легко реализуется автоматический поиск с помощью математических алгоритмов, встроенных в большинство программ обработки изображений для оптической, электронной и зондовой микроскопии.
FemtoScan Online – удобная программа для обработки изображений, она принимает более 100 различных форматов данных, разработанных существующими и уже исчезнувшими компаниями, микроскопы которых используются в лабораториях по всему миру. Программа удобна для анализа больших изображений, так как одновременно могут отображаться два изображения: обзорное изображение со "скользящей" областью и детальное изображение "скользящей" области. При перемещении выделенной области детальное изображение, участок сечения и изображение Фурье изменяются синхронно. Эта функция используется при поиске интересующих объектов. Также в FemtoScan Online 3D-изображения можно просматривать на стереомониторе. Программа осуществляет допечатную подготовку и подготовку презентаций удобным и простым способом: подсветка, настройка цветов и шрифтов, создание 3D-изображений и видео с полетом над поверхностью, стереорежим для 3D-изображений [13, 14].
Несмотря на видимый прогресс в визуализации вирусов с помощью зондовой микроскопии, остается еще много нерешенных проблем. В настоящее время данные зондовой микроскопии вирусов не систематизированы, не создан описательный атлас изображений и морфологии, обнаруженных с помощью микроскопии высокого разрешения. Это одна из задач лаборатории зондовой микроскопии физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-12-00389) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-32-90036).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kuznetsov Yu.G., McPherson A. Atomic Force Microscopy in Imaging of Viruses and Virus-Infected Cells. Microbiology and Molecular Biology Reviews (2011), 75 (2) 268-285. http://dx.doi.org/10.1128/MMBR.00041-10.
Binnig G., Rohrer H. Scanning Tunneling Microscopy, Hely. Phys. Aria 55, (1982), 726.
Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy, IBM Journal of Research and Development. 30 (4) (1986) 355–69.
Binnig G., Quate C.F., Gerber Ch. Atomic Force Microscope, Physical Review Letters. 56 (9) (1986) 930–933.
Dubrovin E.V., Kirikova M.N., Novikov V.K., Drygin Y.F., Yaminsky I.V. Study of the peculiarities of adhesion of tobacco mosaic virus by atomic force microscopy, Colloid Journal, 66(6) (2004) 673–678. http://dx.doi.org/10.1007/s10595-005-0048-x.
Ierardi V., Ferrera F., Millo E., Damonte G., Filaci G., Valbusa U. Bioactive surfaces for antibody-antigen complex detection by Atomic Force Microscopy J. Phys. Conf. Ser., 439, (2013) 012001.
Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Ziborov V.S., Bayzyanova J.M., Konev V.A., Uchaikin V.F., Archakov A.I., Ivanov Y.D. Detection of Hepatitis C Virus Core Protein in Serum Using Aptamer-Functionalized AFM Chips, Micromachines, 10, (2019) 129.
Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors. The Analyst, (2015) 140(17):6131–6137. http://dx.doi.org/10.1039/C5AN 01102G.
Gorelkin P.V. et al. Cantilever sensors based on sialylglycopolymer virus receptor with different readout systems, 2015 IEEE SENSORS, Busan, (2015), pp. 1–4.
Gallyamov M.O., Yaminskii I.V. Quantitative methods for restoration of true topographical properties of objects using the measured afm-images. The effect of broadening of the afm-profile, Surface Investigation X-Ray, Synchrotron and Neutron Techniques, 16(7) (2001) 1135–1141.
Malkin A.J., Land T.A., Kuznetsov Y.G., McPherson A., DeYoreo J.J. Investigation of virus crystal growth mechanisms by in situ atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. (1995). 75:2778–2781.
Электронный ресурс: http://en.nanoscopy.ru/
software/femtoscan_online/
Yaminsky I.V., Filonov A.S., Sinitsyna O.V., Meshkov G.B. Software FemtoScan Online. Nanoindustry, 2 (64) (2016) 42–46.
Filonov A.S., Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online! Why? Nanoindustry, 84 (5) (2018) 339–342. http://dx.doi.org/10.22184/1993-8578.2018.
84.5.336.342.
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, 4, Doct. of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS, А.I.Аkhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.6.340.344
Получено: 29.09.2020 г.
Методы сканирующей зондовой микроскопии были применены для визуализации вирусов растений, животных и человека [1] вскоре после изобретения сканирующей туннельной микроскопии в 1982 году [2, 3] и атомно-силовой микроскопии [4] в 1986 году. С первых же попыток визуализации вирусов стало очевидно, что появился новый высокоинформативный инструмент, который можно использовать в фундаментальных и практических науках, включая вирусологию и медицину. До сих пор определенную уникальную информацию можно получить только с помощью методов сканирующей зондовой микроскопии. Эта информация включает экспериментальные данные о механических свойствах вируса: механической жесткости и стабильности, адгезионных свойствах, силе связывания.
Стоит отметить, что другие мощные методы, основанные на просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), не следует рассматривать как конкурирующие со сканирующей зондовой микроскопией в исследованиях окружающей среды. Методы просвечивающей микроскопии позволяют получать изображения вирусных частиц в вакууме, что прекрасно дополняет данные, полученные с помощью зондовой микроскопии.
Отличительной особенностью зондовой микроскопии от других методов является пробоподготовка. Она не требует специальных навыков. В зондовой микроскопии используются три вида подложек: слюда, графит и стекло. Слюда гидрофильна, что облегчает нанесение образцов с вирусом. Свежесколотый графит является гидрофобным. И у графита, и у слюды можно снять верхний слой, получив идеальную подложку для зондовой микроскопии. У графита высшего качества расстояние между террасами может достигать 10 мкм. Стекло используется гораздо реже, оно не такое равномерно плоское, как графит и слюда. Стекло обычно имеет волнообразный рельеф с амплитудой нанометрового размера. Наблюдаемая топография стекла может затруднить точное измерение размера вируса.
Адгезионную способность слюды и графита можно проиллюстрировать, исследуя вирус табачной мозаики. В зависимости от подложки одна и та же концентрация частиц в образце может различаться для графита и слюды [5].
Функционализированные подложки используются в сенсорных приложениях. В этом случае подложки могут быть покрыты антителами [6], аптамерами [7], синтетическими рецепторами [8, 9].
При подготовке образца с вирусными частицами желательно исключить попадание посторонних объектов, особенно затрудняют визуализацию осевшие частицы из буфера.
Для разбавления образца возможно использование дистиллированной воды: после нанесения суспензии на подложку и пролонгации образец можно промыть. Длительность пролонгации зависит от образца и может составлять от нескольких секунд до 30 мин.
Во время сканирования реальные размеры вирусных частиц могут отличаться. Иногда из-за взаимодействия вируса с подложкой высота может быть меньше реальной. Также высота частицы зависит от подложки: на графите вирус может быть выше, чем на слюде (разница наблюдаемых высот вируса табачной мозаики составляет около 1 нм). Из-за формы кончика кантилевера частицы могут выглядеть шире, чем они есть на самом деле. Это так называемый эффект уширения кантилевера [10]. Точный диаметр вируса можно наблюдать в кристаллической форме [11].
ПО ДЛЯ ОБРАБОТКИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
После сканирования необходимо обработать полученные результаты. Обработка изображений – еще одна высокохудожественная задача. От того, как обрабатывается изображение, сильно зависит интерпретация полученных результатов.
Большинство программных пакетов имеет встроенную службу геометрических измерений и преобразований, которая включает [12]:
- построение сечений и гистограмм,
- измерение расстояний, углов, длин ломаных линий,
- определение шероховатости поверхности,
- измерение периметра выбранной площади,
- автоматическое определение длины изолинии и ее ограниченной площади и объема поверхности,
- удаление среднего склона,
- построение трехмерных изображений,
- выбор наиболее подходящей цветовой палитры.
Распознавание объектов одинаковой формы – одна из важных задач в зондовой микроскопии. Человеческий глаз быстро находит интересующую частицу определенной формы на изображении. Однако для автоматизации этого процесса необходимы четкие математические критерии. При анализе образца с гладкой поверхностью изображение имеет однородный фон, на котором легко реализуется автоматический поиск с помощью математических алгоритмов, встроенных в большинство программ обработки изображений для оптической, электронной и зондовой микроскопии.
FemtoScan Online – удобная программа для обработки изображений, она принимает более 100 различных форматов данных, разработанных существующими и уже исчезнувшими компаниями, микроскопы которых используются в лабораториях по всему миру. Программа удобна для анализа больших изображений, так как одновременно могут отображаться два изображения: обзорное изображение со "скользящей" областью и детальное изображение "скользящей" области. При перемещении выделенной области детальное изображение, участок сечения и изображение Фурье изменяются синхронно. Эта функция используется при поиске интересующих объектов. Также в FemtoScan Online 3D-изображения можно просматривать на стереомониторе. Программа осуществляет допечатную подготовку и подготовку презентаций удобным и простым способом: подсветка, настройка цветов и шрифтов, создание 3D-изображений и видео с полетом над поверхностью, стереорежим для 3D-изображений [13, 14].
Несмотря на видимый прогресс в визуализации вирусов с помощью зондовой микроскопии, остается еще много нерешенных проблем. В настоящее время данные зондовой микроскопии вирусов не систематизированы, не создан описательный атлас изображений и морфологии, обнаруженных с помощью микроскопии высокого разрешения. Это одна из задач лаборатории зондовой микроскопии физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-12-00389) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-32-90036).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kuznetsov Yu.G., McPherson A. Atomic Force Microscopy in Imaging of Viruses and Virus-Infected Cells. Microbiology and Molecular Biology Reviews (2011), 75 (2) 268-285. http://dx.doi.org/10.1128/MMBR.00041-10.
Binnig G., Rohrer H. Scanning Tunneling Microscopy, Hely. Phys. Aria 55, (1982), 726.
Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy, IBM Journal of Research and Development. 30 (4) (1986) 355–69.
Binnig G., Quate C.F., Gerber Ch. Atomic Force Microscope, Physical Review Letters. 56 (9) (1986) 930–933.
Dubrovin E.V., Kirikova M.N., Novikov V.K., Drygin Y.F., Yaminsky I.V. Study of the peculiarities of adhesion of tobacco mosaic virus by atomic force microscopy, Colloid Journal, 66(6) (2004) 673–678. http://dx.doi.org/10.1007/s10595-005-0048-x.
Ierardi V., Ferrera F., Millo E., Damonte G., Filaci G., Valbusa U. Bioactive surfaces for antibody-antigen complex detection by Atomic Force Microscopy J. Phys. Conf. Ser., 439, (2013) 012001.
Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Ziborov V.S., Bayzyanova J.M., Konev V.A., Uchaikin V.F., Archakov A.I., Ivanov Y.D. Detection of Hepatitis C Virus Core Protein in Serum Using Aptamer-Functionalized AFM Chips, Micromachines, 10, (2019) 129.
Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors. The Analyst, (2015) 140(17):6131–6137. http://dx.doi.org/10.1039/C5AN 01102G.
Gorelkin P.V. et al. Cantilever sensors based on sialylglycopolymer virus receptor with different readout systems, 2015 IEEE SENSORS, Busan, (2015), pp. 1–4.
Gallyamov M.O., Yaminskii I.V. Quantitative methods for restoration of true topographical properties of objects using the measured afm-images. The effect of broadening of the afm-profile, Surface Investigation X-Ray, Synchrotron and Neutron Techniques, 16(7) (2001) 1135–1141.
Malkin A.J., Land T.A., Kuznetsov Y.G., McPherson A., DeYoreo J.J. Investigation of virus crystal growth mechanisms by in situ atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. (1995). 75:2778–2781.
Электронный ресурс: http://en.nanoscopy.ru/
software/femtoscan_online/
Yaminsky I.V., Filonov A.S., Sinitsyna O.V., Meshkov G.B. Software FemtoScan Online. Nanoindustry, 2 (64) (2016) 42–46.
Filonov A.S., Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online! Why? Nanoindustry, 84 (5) (2018) 339–342. http://dx.doi.org/10.22184/1993-8578.2018.
84.5.336.342.
Отзывы читателей
