eng
Выпуск #7-8/2020
З.С.Плиева, Т.А.Смирнова, М.В.Зубашева, Ю.А.Смирнов, В.Г.Жуховицкий, А.И.Ахметова, И.В.Яминский
Структура экзоспориума спор bacillus cereus
Структура экзоспориума спор bacillus cereus
Просмотры: 2357
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.426.432
В окружающей среде бациллы B. cereus адаптированы к сапрофитному образу жизни. При определенных условиях они могут стать патогенами для человека и животных. Интерес к бациллам В. cereus связан с тем, что они являются причиной заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а также могут вызывать септицемию, эндокардит, пневмонию, менингит и др. Важным этапом жизненного цикла В. cereus является спорообразование. Споры В. cereus имеют специфические структуры, отсутствующие у вегетативных клеток и отвечающие за такие свойства спор, как термоустойчивость, резистентность к различным повреждающим факторам, адгезию к биотическим и абиотическим поверхностям. Получены данные о тонкой структуре экзоспориума B. cerеus с помощью просвечивающей электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений.
В окружающей среде бациллы B. cereus адаптированы к сапрофитному образу жизни. При определенных условиях они могут стать патогенами для человека и животных. Интерес к бациллам В. cereus связан с тем, что они являются причиной заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а также могут вызывать септицемию, эндокардит, пневмонию, менингит и др. Важным этапом жизненного цикла В. cereus является спорообразование. Споры В. cereus имеют специфические структуры, отсутствующие у вегетативных клеток и отвечающие за такие свойства спор, как термоустойчивость, резистентность к различным повреждающим факторам, адгезию к биотическим и абиотическим поверхностям. Получены данные о тонкой структуре экзоспориума B. cerеus с помощью просвечивающей электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений.
Теги: exosporium microelectronics transmission electron microscopy в. cereus просвечивающая электронная микроскопия экзоспориум
СТРУКТУРА ЭКЗОСПОРИУМА СПОР BACILLUS CEREUS
STRUCTURE OF EXOSPORIUM OF SPORES OF BACILLUS CEREUS
З.С.Плиева1, мл. науч. сотр., (ORCID: 0000-0001-9765-8623), Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр.,
(ORCID: 0000-0001-7121-635Х), М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр., (ORCID: 0000-0001-7330-7343), Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр., (ORCID: 0000-0002-2215-5420), В.Г.Жуховицкий1, к.м.н., руководитель лаборатории, (ORCID: 0000-0002-4653-2446), А.И.Ахметова 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0002-5115-8030), И.В.Яминский2, 3, 4, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова, вед. научн. сотр. ИНЭОС РАН, директор Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0001-8731-3947) / yaminsky@nanoscopy.ru
Z.S.Plieva1, Junior Researcher, T.A.Smirnova1, Doct. of Sc. (Biology), Leading Scientist, М.V.Zubasheva1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sc. (Medicine), Prof., Leading Scientist, V.G.Zhukovitskiy1, Cand. of Sc. (Medicine), Head of Laboratory, A.I.Akhmetova2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, I.V.Yaminskiy,2, 3, 4, Doct. of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.426.432
Получено: 9.11.2020 г.
ВВЕДЕНИЕ
К спороспецифическим структурам относятся экзоспориум, споровая оболочка, внешняя мембрана споры, кортекс, внутреняя мембрана споры и седцевина. У ряда бактерий с внешней стороны оболочки формируется экзоспориум, строение которого специфично для различных видов. Для В. cereus характерен экзоспориум в виде наружного тонкого чехла, окружающего спору [1]. Экзоспориум непосредственно вступает в контакт с внешней средой, в отличие от более глубоко расположенных структур. Экзоспориум играет роль в резистентности, адгезии, распространении спор, их взаимодействии с хозяином и в контроле прорастания. Экзоспориум имеет сложный химический состав, содержит белок (∼52%), липиды и полисахариды [2].
Экзоспориум В. cereus снабжен характерными длинными выростами, которые имеют сходный с ним химический состав и общие антигены.
Экзоспориум визуализируется просвечивающей электронной (ПЭМ), сканирующей электронной (СЭМ) и атомно-силовой микроскопией (АСМ). Экзоспориум хорошо виден при использовании методов негативного контрастирования, ультратонких срезов. Строение экзоспориума было детально исследовано P. Gerhardt, E. Ribi [3], которые показали, что эта структура состоит из двух слоев: наружного, имеющего короткие волосовидные выросты, и внутреннего паракристаллического, гексагонально перфорированного базального слоя с отверстиями размером 76 Å от центра к центру [3]. Дальнейшие электронно-микроскопические исследования подтвердили эти данные.
Ранее с целью определения параметров упаковки морфологических субъединиц у экзоспориума B. thuringiensis, бацилл из группы В. cereus, мы проводили анализ электронно-микроскопических снимков методом оптической дифракции [4]. Обработка электронно-микроскопических снимков с помощью оптической дифракции проводится для объектов с периодической структурой. Техника оптической дифракции и фильтрации используется для получения точной информации о строении регулярных слоев.
Изображение экзоспориума на электронно-микроскопических снимках представляет собой результат наложения его верхнего и нижнего слоев. На дифрактограмме участка экзоспориума были обнаружены шесть двойных рефлексов, угол между которыми составлял 9°, указывающих на наличие двух слоев с гексагональной периодичностью, сдвинутых по отношению друг к другу на 9°. На фильтрованном изображении экзоспориума B. thuringiensis мы получили усредненные морфологические единицы с отверстиями в центре, что согласуется с представлением об экзоспориуме как о порозной структуре.
По данным Ball et al. [5], в экзоспориуме B. cereus имеются поры размером 23–34 Å. Авторами сделан вывод о том, что экзоспориум является полупроницаемым барьером, позволяющим проникать триггерам прорастания аланину или инозину, но не гидролитическим ферментам и антителам.
Ультраструктура экзоспориума способствует выполнению защитной функции благодаря избирательной способности пропускать низкомолекулярные вещества и задерживать высокомолекулярные.
Споры могут различаться по размеру экзоспориума. Оказалось, что и адгезивная способность спор варьируется от штамма к штамму. Наиболее активно контаминируют поверхности споры с небольшим экзоспориумом [6]. Споры по таким своим свойствам, как адгезивность и устойчивость к повреждающим факторам внешней среды, являются опасными для пищевой промышленности и медицины. Для оценки их способности контаминировать оборудование пищевой промышленности и медицинского инструментария представляет интерес изучить внешние структуры спор (экзоспориума и выростов) у штаммов B. cereus различного происхождения. Анализ строения поверхности спор важен и для выбора метода борьбы со спорообразующими бактериями.
Целью данного исследования является ультраструктурный анализ внешних споровых структур (экзоспориума) различных штаммов B. cereus методами электронной микроскопии, оптической дифракции и фильтрации. Результаты исследования важны для понимания роли экологической ниши, занимаемой штаммами B. cereus в формировании их фенотипических свойств. Известна способность B. cereus осваивать разнообразные экологические ниши и выживать в экстремальных условиях, что может повлечь нежелательные последствия для людей и животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали коллекционный штамм NCTC 8035 и природные штаммы (137\0719, 114/0719, 115\079, 131\079) B. cereus. Штаммы выращивали на агаризованном питательном бульоне LB при 28 °С в течение 96 ч. Клинические изоляты были получены из просветных фекалий пациентов с язвенным колитом (ЯК) в Государственном научном центре колопроктологии им. А.Н.Рыжих Минздрава России, обозначенные как B.сerеus SCCC 1208 и B cerеus SCCC 19/16. Исследовали также следующие штаммы: штамм B. cereus 169, выделенный из отделяемого брюшной полости у больного с ЯК; штамм B. cereus 177, выделенный из просветных фекалий; штамм B. cereus 172, выделенный из просветных фекалий; штамм B. cereus 214/18, выделенный из операционной раны пациента с ЯК; штамм B. cereus 239/18, выделенный из крови пациента с ЯК и подтвержденным диагнозом сепсиса; штамм B. cereus 223/18, выделенный из брюшной полости пациента с ЯК; штамм B. cereus 181, выделенный из операционной раны пациента с ЯК. Среда выращивания – кровяной агар. Штаммы пересевали на твердую питательную среду NBY и выращивали при 28 °С в течение 96 ч.
Бактерии через 96 ч культивирования смывали с плотной питательной среды, отмывали дистиллированной водой и фиксировали формалином. Для изучения спор методом негативного контрастирования суспензию спор наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой и окрашивали 1%-ным водным раствором уранилацетата или 2%-ным водным раствором молибдата аммония.
Для получения ультратонких срезов образцы фиксировали по методу Ито-Карновски [7]. Затем материал фиксировали в 1%-ном ОsО4 растворе на 0,2 М какодилатном буфере и в 1%-ном растворе уранилацетата на 0,2 М малеатном буфере. Материал обезвоживали в спиртах с концентрациями 50°, 70°, 96°, 100°. Далее помещали в смесь 100° спирта со смолой LR White, а затем в чистую смолу LR White. Материал переносили в желатиновые капсулы, которые помещали в термостат при 56 °C. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB III (LKB Bromma, Sweden) и контрастировали 1%-ным раствором уранилацетата в 70°-ном спирте и лимонно-кислым свинцом. Негативно окрашенные споры и срезы изучали в электронном микроскопе JEM 2100 (Jeol, Japan) при ускоряющем напряжении 160 кВ.
Анализ изображений проводился в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" (Центр перспективных технологий, Москва, www.nanoscopy.ru) [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Было проведено электронно-микроскопическое изучение спор штаммов как клинических изолятов, так и природных штаммов B. cereus методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. На ультратонких срезах (рис.1) представлены зрелые споры штамма 293, выделенного из крови больного ЯК с характерной для B. cereus ультраструктурой. На поперечных срезах наблюдаются экзоспориум в виде тонкой волнистой линии, экзоспориальное пространство, отделяющее экзоспориум от споровой электронно-плотной оболочки, электронно-прозрачный кортекс, сердцевина в центре споры. Эти результаты дают общее представление о строении споры B. cereus. Все исследованные штаммы имели сходную ультраструктуру.
Однако при изучении срезов не удается рассмотреть тонкую структуру экзоспориума. С целью визуализации экзоспориума использовали метод негативного контрастирования. На рис.2 представлена спора штамма 8035, заключенная в электронно-прозрачный экзоспориум с выростами. Аналогичные данные были получены при изучении всех штаммов, использованных в работе. На рис.3 представлен фрагмент экзоспориума того же штамма с гексагональной упаковкой субъединиц.
В рамках исследования было проведенa фурье-фильтрация кристаллической структуры базального слоя экзоспориума в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" [8]. С помощью фурье-фильтрации возможно как сглаживание объектов, так и выделение мелких деталей на изображении. Фурье-фильтрация позволяет эффективно выделить периодическую структуру на фоне общей зашумленности изображения. В частности, на рис.4 показан результат реализации фурье-фильтрации нижней левой области экзоспориума на рис.3 размером 110 × 120 мкм (рис.4a). Рис.4d демонстрирует изображение после исключения высокочастотных и низкочастотных шумов (см. рис. 4b и c), что значительно облегчает восприятие рассматриваемой гексагональной структуры базального слоя экзоспориума (рис.5).
На рис.4d и 5 заметно муаровое изменение наблюдаемого контраста гексагональной упаковки слоев экзоспориума. Фактически, на изображении представлено наложение двух слоев экзоспориума – верхнего и нижнего, повернутых друг относительно друга на небольшой угол. В соответствии с сечением, представленным на рис.5, наблюдаемое характерное расстояние между порами одного слоя экзоспориума составляет величину около 6 нм.
Таким образом, с помощью просвечивающей электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений получены данные о тонкой структуре экзоспориума B. cerеus. Представлены фрагменты экзоспориума после фурье-фильтрации, демонстрирующие очищенную от шумов гексагональную структуру, характерную для B. cerеus.
Работа Яминского И.В. выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-12-00389), работа Ахметовой А.И. – при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 20-32-90036 и № 21-58-10005).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Stewart G.C. The Exosporium Layer of Bacterial Spores: a Connection to the Environment and the Infected Host. Microbiol Mol Biol Re, v. 79 (4) (2015), pp. 437–457.
Matz L.L., Beaman T.C., Gerhardt P. Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus. J Bacteriol. 101 (1970), pp. 196–201.
Gerhardt P., Ribi E. Ultrastucture of the exosporium enveloping spores of bacillus cereus. J. of Bacteriology. 88 (6) (1964), pp. 1774–1789.
Smirnova T.A., Mikhailov A.M., Tiurin V.S., Azizbekian R.R. Ultrastructure of the bacterial spores and crystals of various Bacillus thuringiensis serotypes. Mikrobiologiya. 53 (1984), pp. 455–462.
Ball D.A., Taylor R., Todd S.J. et al. Structure of exosporium and sublayers of spores of the Bacillus cereus family revealed by electron crystallography. Molecul. microbiol. 68(4) (2008), pp. 947–958.
Tauveron G., Slomianny C., Henry C., Faille C. Variability among Bacillus cereus strains in the spore surface properties and influence on their ability to contaminate food surface equipment. Int. J. Food Microbiol, 110 (2006), pp. 254–262.
Ito S., Karnovsky M. Formaldehide glutaraldehide fixatives containing trinitrocompound. J. Cell biol, v. 39, (1969), pp. 168a–169a.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online software and visualization of nanoobjects in high resolution microscopy. Nanoindustry, 11 (6 (85)) (2018), pp. 414–416.
STRUCTURE OF EXOSPORIUM OF SPORES OF BACILLUS CEREUS
З.С.Плиева1, мл. науч. сотр., (ORCID: 0000-0001-9765-8623), Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр.,
(ORCID: 0000-0001-7121-635Х), М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр., (ORCID: 0000-0001-7330-7343), Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр., (ORCID: 0000-0002-2215-5420), В.Г.Жуховицкий1, к.м.н., руководитель лаборатории, (ORCID: 0000-0002-4653-2446), А.И.Ахметова 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0002-5115-8030), И.В.Яминский2, 3, 4, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова, вед. научн. сотр. ИНЭОС РАН, директор Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0001-8731-3947) / yaminsky@nanoscopy.ru
Z.S.Plieva1, Junior Researcher, T.A.Smirnova1, Doct. of Sc. (Biology), Leading Scientist, М.V.Zubasheva1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sc. (Medicine), Prof., Leading Scientist, V.G.Zhukovitskiy1, Cand. of Sc. (Medicine), Head of Laboratory, A.I.Akhmetova2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, I.V.Yaminskiy,2, 3, 4, Doct. of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.426.432
Получено: 9.11.2020 г.
ВВЕДЕНИЕ
К спороспецифическим структурам относятся экзоспориум, споровая оболочка, внешняя мембрана споры, кортекс, внутреняя мембрана споры и седцевина. У ряда бактерий с внешней стороны оболочки формируется экзоспориум, строение которого специфично для различных видов. Для В. cereus характерен экзоспориум в виде наружного тонкого чехла, окружающего спору [1]. Экзоспориум непосредственно вступает в контакт с внешней средой, в отличие от более глубоко расположенных структур. Экзоспориум играет роль в резистентности, адгезии, распространении спор, их взаимодействии с хозяином и в контроле прорастания. Экзоспориум имеет сложный химический состав, содержит белок (∼52%), липиды и полисахариды [2].
Экзоспориум В. cereus снабжен характерными длинными выростами, которые имеют сходный с ним химический состав и общие антигены.
Экзоспориум визуализируется просвечивающей электронной (ПЭМ), сканирующей электронной (СЭМ) и атомно-силовой микроскопией (АСМ). Экзоспориум хорошо виден при использовании методов негативного контрастирования, ультратонких срезов. Строение экзоспориума было детально исследовано P. Gerhardt, E. Ribi [3], которые показали, что эта структура состоит из двух слоев: наружного, имеющего короткие волосовидные выросты, и внутреннего паракристаллического, гексагонально перфорированного базального слоя с отверстиями размером 76 Å от центра к центру [3]. Дальнейшие электронно-микроскопические исследования подтвердили эти данные.
Ранее с целью определения параметров упаковки морфологических субъединиц у экзоспориума B. thuringiensis, бацилл из группы В. cereus, мы проводили анализ электронно-микроскопических снимков методом оптической дифракции [4]. Обработка электронно-микроскопических снимков с помощью оптической дифракции проводится для объектов с периодической структурой. Техника оптической дифракции и фильтрации используется для получения точной информации о строении регулярных слоев.
Изображение экзоспориума на электронно-микроскопических снимках представляет собой результат наложения его верхнего и нижнего слоев. На дифрактограмме участка экзоспориума были обнаружены шесть двойных рефлексов, угол между которыми составлял 9°, указывающих на наличие двух слоев с гексагональной периодичностью, сдвинутых по отношению друг к другу на 9°. На фильтрованном изображении экзоспориума B. thuringiensis мы получили усредненные морфологические единицы с отверстиями в центре, что согласуется с представлением об экзоспориуме как о порозной структуре.
По данным Ball et al. [5], в экзоспориуме B. cereus имеются поры размером 23–34 Å. Авторами сделан вывод о том, что экзоспориум является полупроницаемым барьером, позволяющим проникать триггерам прорастания аланину или инозину, но не гидролитическим ферментам и антителам.
Ультраструктура экзоспориума способствует выполнению защитной функции благодаря избирательной способности пропускать низкомолекулярные вещества и задерживать высокомолекулярные.
Споры могут различаться по размеру экзоспориума. Оказалось, что и адгезивная способность спор варьируется от штамма к штамму. Наиболее активно контаминируют поверхности споры с небольшим экзоспориумом [6]. Споры по таким своим свойствам, как адгезивность и устойчивость к повреждающим факторам внешней среды, являются опасными для пищевой промышленности и медицины. Для оценки их способности контаминировать оборудование пищевой промышленности и медицинского инструментария представляет интерес изучить внешние структуры спор (экзоспориума и выростов) у штаммов B. cereus различного происхождения. Анализ строения поверхности спор важен и для выбора метода борьбы со спорообразующими бактериями.
Целью данного исследования является ультраструктурный анализ внешних споровых структур (экзоспориума) различных штаммов B. cereus методами электронной микроскопии, оптической дифракции и фильтрации. Результаты исследования важны для понимания роли экологической ниши, занимаемой штаммами B. cereus в формировании их фенотипических свойств. Известна способность B. cereus осваивать разнообразные экологические ниши и выживать в экстремальных условиях, что может повлечь нежелательные последствия для людей и животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали коллекционный штамм NCTC 8035 и природные штаммы (137\0719, 114/0719, 115\079, 131\079) B. cereus. Штаммы выращивали на агаризованном питательном бульоне LB при 28 °С в течение 96 ч. Клинические изоляты были получены из просветных фекалий пациентов с язвенным колитом (ЯК) в Государственном научном центре колопроктологии им. А.Н.Рыжих Минздрава России, обозначенные как B.сerеus SCCC 1208 и B cerеus SCCC 19/16. Исследовали также следующие штаммы: штамм B. cereus 169, выделенный из отделяемого брюшной полости у больного с ЯК; штамм B. cereus 177, выделенный из просветных фекалий; штамм B. cereus 172, выделенный из просветных фекалий; штамм B. cereus 214/18, выделенный из операционной раны пациента с ЯК; штамм B. cereus 239/18, выделенный из крови пациента с ЯК и подтвержденным диагнозом сепсиса; штамм B. cereus 223/18, выделенный из брюшной полости пациента с ЯК; штамм B. cereus 181, выделенный из операционной раны пациента с ЯК. Среда выращивания – кровяной агар. Штаммы пересевали на твердую питательную среду NBY и выращивали при 28 °С в течение 96 ч.
Бактерии через 96 ч культивирования смывали с плотной питательной среды, отмывали дистиллированной водой и фиксировали формалином. Для изучения спор методом негативного контрастирования суспензию спор наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой и окрашивали 1%-ным водным раствором уранилацетата или 2%-ным водным раствором молибдата аммония.
Для получения ультратонких срезов образцы фиксировали по методу Ито-Карновски [7]. Затем материал фиксировали в 1%-ном ОsО4 растворе на 0,2 М какодилатном буфере и в 1%-ном растворе уранилацетата на 0,2 М малеатном буфере. Материал обезвоживали в спиртах с концентрациями 50°, 70°, 96°, 100°. Далее помещали в смесь 100° спирта со смолой LR White, а затем в чистую смолу LR White. Материал переносили в желатиновые капсулы, которые помещали в термостат при 56 °C. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB III (LKB Bromma, Sweden) и контрастировали 1%-ным раствором уранилацетата в 70°-ном спирте и лимонно-кислым свинцом. Негативно окрашенные споры и срезы изучали в электронном микроскопе JEM 2100 (Jeol, Japan) при ускоряющем напряжении 160 кВ.
Анализ изображений проводился в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" (Центр перспективных технологий, Москва, www.nanoscopy.ru) [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Было проведено электронно-микроскопическое изучение спор штаммов как клинических изолятов, так и природных штаммов B. cereus методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. На ультратонких срезах (рис.1) представлены зрелые споры штамма 293, выделенного из крови больного ЯК с характерной для B. cereus ультраструктурой. На поперечных срезах наблюдаются экзоспориум в виде тонкой волнистой линии, экзоспориальное пространство, отделяющее экзоспориум от споровой электронно-плотной оболочки, электронно-прозрачный кортекс, сердцевина в центре споры. Эти результаты дают общее представление о строении споры B. cereus. Все исследованные штаммы имели сходную ультраструктуру.
Однако при изучении срезов не удается рассмотреть тонкую структуру экзоспориума. С целью визуализации экзоспориума использовали метод негативного контрастирования. На рис.2 представлена спора штамма 8035, заключенная в электронно-прозрачный экзоспориум с выростами. Аналогичные данные были получены при изучении всех штаммов, использованных в работе. На рис.3 представлен фрагмент экзоспориума того же штамма с гексагональной упаковкой субъединиц.
В рамках исследования было проведенa фурье-фильтрация кристаллической структуры базального слоя экзоспориума в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" [8]. С помощью фурье-фильтрации возможно как сглаживание объектов, так и выделение мелких деталей на изображении. Фурье-фильтрация позволяет эффективно выделить периодическую структуру на фоне общей зашумленности изображения. В частности, на рис.4 показан результат реализации фурье-фильтрации нижней левой области экзоспориума на рис.3 размером 110 × 120 мкм (рис.4a). Рис.4d демонстрирует изображение после исключения высокочастотных и низкочастотных шумов (см. рис. 4b и c), что значительно облегчает восприятие рассматриваемой гексагональной структуры базального слоя экзоспориума (рис.5).
На рис.4d и 5 заметно муаровое изменение наблюдаемого контраста гексагональной упаковки слоев экзоспориума. Фактически, на изображении представлено наложение двух слоев экзоспориума – верхнего и нижнего, повернутых друг относительно друга на небольшой угол. В соответствии с сечением, представленным на рис.5, наблюдаемое характерное расстояние между порами одного слоя экзоспориума составляет величину около 6 нм.
Таким образом, с помощью просвечивающей электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений получены данные о тонкой структуре экзоспориума B. cerеus. Представлены фрагменты экзоспориума после фурье-фильтрации, демонстрирующие очищенную от шумов гексагональную структуру, характерную для B. cerеus.
Работа Яминского И.В. выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-12-00389), работа Ахметовой А.И. – при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 20-32-90036 и № 21-58-10005).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Stewart G.C. The Exosporium Layer of Bacterial Spores: a Connection to the Environment and the Infected Host. Microbiol Mol Biol Re, v. 79 (4) (2015), pp. 437–457.
Matz L.L., Beaman T.C., Gerhardt P. Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus. J Bacteriol. 101 (1970), pp. 196–201.
Gerhardt P., Ribi E. Ultrastucture of the exosporium enveloping spores of bacillus cereus. J. of Bacteriology. 88 (6) (1964), pp. 1774–1789.
Smirnova T.A., Mikhailov A.M., Tiurin V.S., Azizbekian R.R. Ultrastructure of the bacterial spores and crystals of various Bacillus thuringiensis serotypes. Mikrobiologiya. 53 (1984), pp. 455–462.
Ball D.A., Taylor R., Todd S.J. et al. Structure of exosporium and sublayers of spores of the Bacillus cereus family revealed by electron crystallography. Molecul. microbiol. 68(4) (2008), pp. 947–958.
Tauveron G., Slomianny C., Henry C., Faille C. Variability among Bacillus cereus strains in the spore surface properties and influence on their ability to contaminate food surface equipment. Int. J. Food Microbiol, 110 (2006), pp. 254–262.
Ito S., Karnovsky M. Formaldehide glutaraldehide fixatives containing trinitrocompound. J. Cell biol, v. 39, (1969), pp. 168a–169a.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online software and visualization of nanoobjects in high resolution microscopy. Nanoindustry, 11 (6 (85)) (2018), pp. 414–416.
Отзывы читателей
