eng
Выпуск #6/2021
И.В.Яминский, А.И.Ахметова, С.А.Сенотрусова
Новый взгляд на оптическую микроскопию бактерий сквозь микролинзы
Новый взгляд на оптическую микроскопию бактерий сквозь микролинзы
Просмотры: 1282
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.6.336.340
Выполнение высокочувствительных и селективных измерений бактериальных клеток в реальном времени остается сложной задачей. Стандартные методы идентификации организмов, такие как тесты антитело-антиген, тесты на C-реактивный белок или прокальцитонин очень чувствительны, но дороги. Более доступные методы, обеспечивающие необходимую чувствительность, избирательность и надежность, требуют минимум 24 ч для получения результатов, что может быть критично для некоторых случаев заболеваний. Следовательно, для борьбы с появлением устойчивых к лекарствам штаммов бактерий необходимы недорогие и простые методы быстрого обнаружения и исследования бактерий.
Выполнение высокочувствительных и селективных измерений бактериальных клеток в реальном времени остается сложной задачей. Стандартные методы идентификации организмов, такие как тесты антитело-антиген, тесты на C-реактивный белок или прокальцитонин очень чувствительны, но дороги. Более доступные методы, обеспечивающие необходимую чувствительность, избирательность и надежность, требуют минимум 24 ч для получения результатов, что может быть критично для некоторых случаев заболеваний. Следовательно, для борьбы с появлением устойчивых к лекарствам штаммов бактерий необходимы недорогие и простые методы быстрого обнаружения и исследования бактерий.
Теги: antibody antigen c-reactive protein microlens microscopy of bacteria strains of bacteria антитело-антиген микролинзы микроскопия бактерий с-реактивный белок штаммы бактерий
НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА ОПТИЧЕСКУЮ МИКРОСКОПИЮ БАКТЕРИЙ СКВОЗЬ МИКРОЛИНЗЫ
NEW LOOK ON THE OPTICAL MICROSCOPY OF BACTERIA THROUGH MICROLENS
И.В.Яминский1, 2, 3, д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0002-5115-8030), С.А.Сенотрусова1, студент, (ORCID: 0000-0003-0960-8920) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, S.A.Senotrusova1, student
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.6.336.340
Получено: 11.09.2021 г.
Выполнение высокочувствительных и селективных измерений бактериальных клеток в реальном времени остается сложной задачей [1]. Стандартные методы идентификации организмов, такие как тесты антитело-антиген, тесты на C-реактивный белок или прокальцитонин очень чувствительны, но в то же время и довольно дороги. Более доступные методы, такие как выращивание на чашке с агаром, могут обеспечить необходимую чувствительность, избирательность и надежность, но обычно требуют минимум 24 ч для получения окончательных результатов, что может быть критическим для некоторых случаев заболеваний. Следовательно, для борьбы с появлением устойчивых к лекарствам штаммов бактерий необходимы недорогие и простые методы для быстрого обнаружения и исследования бактерий.
ВВЕДЕНИЕ
Атомно-силовая микроскопия – традиционный инструмент для исследования морфологии бактериальных клеток, позволяющий детально изучить строение и адгезионную способность поверхностной мембраны клетки, оценить адсорбцию на различных подложках и воздействие лекарственных препаратов. Помимо этого, АСМ может выступать в качестве сенсора для определения метаболизма бактерии в различных условиях среды и под воздействием реагентов.
Данный метод основан на том принципе, что молекулярное распознавание на поверхности микромеханической системы (например, кантилевера) приводит к изгибу (отклонению) на несколько нанометров (статический режим) или к изменению резонансной частоты (динамический режим) [3–5]. Эти системы обладают уникальными свойствами, поскольку позволяют проводить исследование без меток и имеют высокую потенциальную чувствительность. Было показано, что низкочастотные колебания кантилеверов атомно-силовой микроскопии можно использовать для характеристики бактерий, быстрого тестирования их чувствительности к антибиотикам и определения устойчивости в течение нескольких минут [6, 7]. На практике бактерии помещают на кантилевер и детектируют колебания, которые напрямую коррелируют с метаболизмом клеток. Было продемонстрировано, что движение кантилевера обусловлено движением мембран в живых клетках и исчезает в случае смерти бактерии [8]. Характерный диапазон колебаний бактериальных клеток E.coli 0,01–1 кГц [9].
Многие биологические процессы, происходящие внутри живых бактерий, зависят от механических свойств самой мембраны. Исследование движения и осцилляции мембраны бактериальных клеток с помощью АСМ является неинвазивным и не зависит от использования химических красителей, флуоресцентных маркеров или квантовых точек. Скорость и амплитуда движения отражают активные метаболические процессы, рост, подвижность.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В данной работе мы исследуем характерное движение и осцилляции мембраны бактериальных клеток с помощью измерительной схемы зондового микроскопа "ФемтоСкан". При изменениях на поверхностном слое вследствие адсорбции частиц (в случае обнаружения) или при изменении поверхностного натяжения изменяется резонансная частота колебаний пьезокерамического биочипа, что может быть зарегистрировано схемой и преобразовано в количественный результат с помощью ПО "ФемтоСкан Онлайн". Контрольное измерение колебаний биочипа представлено на рис.1.
Параллельно с наблюдением бактерий в атомно-силовой микроскоп для их визуализации можно использовать метод микролинзовой микроскопии [10, 11]. Оптическая микроскопия ограничена дифракционным пределом, который удается преодолеть благодаря использованию линз микронного диаметра. На рис.4 представлено изображение калибровочного образца – поверхности микросхемы, полученное с помощью оптического микроскопа Axio Scope 40 Carl Zeiss и микролинзы диаметром 20 мкм из титаната бария, расположенной на поверхности образца.
ВЫВОДЫ
В наших исследованиях микролинзовая микроскопия позволяет исследовать образцы бактерий параллельно с зондовой микроскопией за счет использования установки для совмещенной зондовой, оптической и микролинзовой микроскопии. При этом микролинзовая микроскопия существенно сокращает требуемое время на поиск бактерий на подложке для последующих детальных измерений методами сканирующей зондовой микроскопии.
Часто для оценки состояния бактериальной клетки статического изображения недостаточно. Требуется проводить комплексное наблюдение во времени с применением набора методов. Для этого уверенно подходят атомно-силовая микроскопия, микролинзовая микроскопия и регистрация колебаний мембраны клетки с помощью микромеханической системы методам резонанса.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РНФ, проект № 20-12-00389, РФФИ, проект № 20-32-90036.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Morency-Potvin P., Schwartz D.N., Weinstein R.A. Antimicrobial stewardship: How the microbiology laboratory can right the ship. Clin. Microbiol. Rev. 2017, 30, 381–407. https://doi.org/10.1128/CMR.00066-16
Huber F., Lang H.P., Backmann N., Rimoldi D., Gerber C. Direct detection of a BRAF mutation in total RNA from melanoma cells using cantilever arrays. Nat Nanotechnol. 2013, 8(2), 125–129. https://doi.org/10.1038/nnano.2012.263
Etayash H., McGee A.R., Kaurac K., Thundat T. Nanomechanical sandwich assay for multiple cancer biomarkers in breast cancer cell-derived exosomes. Nanoscale, 2016, 8, 15137–15141. https://doi.org/10.1039/C6NR03478K
Duffy J., Padovani F., Brunetti G., Noy P., Certa U., Hegner M. Towards personalised rapid label free miRNA detection for cancer and liver injury diagnostics in cell lysates and blood based samples. Nanoscale, 2018, 10, 12797–12804. https://doi.org/10.1039/C8NR03604G
Longo G., Alonso-Sarduy L., Marques Rio L., Bizzini A., Trampuz A., Notz J., Dietler G., Kasas S. Rapid detection of bacterial resistance to antibiotics using AFM cantilevers as nanomechanical sensors. Nat. Nanotechnol., 2013, 8(7), 522–526. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.120
Kasas S., Ruggeri F.S., Benadiba C., Maillard C., Stupar P., Tournu H., Dietler G., Longo G. Detecting Nanoscale Vibrations as Signature of Life. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 378–381.
Mustazzolu A., Venturelli L., Dinarelli S., Brown K., Floto R.A., Dietler G., Fattorini L., Kasas S., Girasole M., Longo G. A Rapid Unraveling of the Activity and Antibiotic Susceptibility of Mycobacteria. Antimicrob. Agents. Chemother. 2019, 63. https://doi.org/10.1128/AAC.02194-18
Mertens J., Cuervo A., Carrascosa J.L. Nanomechanical detection of Escherichia coli infection by bacteriophage T7 using cantilever sensors. Nanoscale, 2019, 11, 17689. https://doi.org/10.1039/c 9nr05240b
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Senotrusova S.A. Microlens microscopy opens up new possibilities in the visualization of biological objects. Medicine and high technologies, 2021, 1, 51–55. https://doi.org/10.34219/2306-3645-2021-11-1-51-55
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Senotrusova S.A. Optical microscopy using microlenses. Nanoindustry, 2021, 14, 3–4, 22–25. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.3-4.184.187
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
NEW LOOK ON THE OPTICAL MICROSCOPY OF BACTERIA THROUGH MICROLENS
И.В.Яминский1, 2, 3, д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0002-5115-8030), С.А.Сенотрусова1, студент, (ORCID: 0000-0003-0960-8920) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, S.A.Senotrusova1, student
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.6.336.340
Получено: 11.09.2021 г.
Выполнение высокочувствительных и селективных измерений бактериальных клеток в реальном времени остается сложной задачей [1]. Стандартные методы идентификации организмов, такие как тесты антитело-антиген, тесты на C-реактивный белок или прокальцитонин очень чувствительны, но в то же время и довольно дороги. Более доступные методы, такие как выращивание на чашке с агаром, могут обеспечить необходимую чувствительность, избирательность и надежность, но обычно требуют минимум 24 ч для получения окончательных результатов, что может быть критическим для некоторых случаев заболеваний. Следовательно, для борьбы с появлением устойчивых к лекарствам штаммов бактерий необходимы недорогие и простые методы для быстрого обнаружения и исследования бактерий.
ВВЕДЕНИЕ
Атомно-силовая микроскопия – традиционный инструмент для исследования морфологии бактериальных клеток, позволяющий детально изучить строение и адгезионную способность поверхностной мембраны клетки, оценить адсорбцию на различных подложках и воздействие лекарственных препаратов. Помимо этого, АСМ может выступать в качестве сенсора для определения метаболизма бактерии в различных условиях среды и под воздействием реагентов.
Данный метод основан на том принципе, что молекулярное распознавание на поверхности микромеханической системы (например, кантилевера) приводит к изгибу (отклонению) на несколько нанометров (статический режим) или к изменению резонансной частоты (динамический режим) [3–5]. Эти системы обладают уникальными свойствами, поскольку позволяют проводить исследование без меток и имеют высокую потенциальную чувствительность. Было показано, что низкочастотные колебания кантилеверов атомно-силовой микроскопии можно использовать для характеристики бактерий, быстрого тестирования их чувствительности к антибиотикам и определения устойчивости в течение нескольких минут [6, 7]. На практике бактерии помещают на кантилевер и детектируют колебания, которые напрямую коррелируют с метаболизмом клеток. Было продемонстрировано, что движение кантилевера обусловлено движением мембран в живых клетках и исчезает в случае смерти бактерии [8]. Характерный диапазон колебаний бактериальных клеток E.coli 0,01–1 кГц [9].
Многие биологические процессы, происходящие внутри живых бактерий, зависят от механических свойств самой мембраны. Исследование движения и осцилляции мембраны бактериальных клеток с помощью АСМ является неинвазивным и не зависит от использования химических красителей, флуоресцентных маркеров или квантовых точек. Скорость и амплитуда движения отражают активные метаболические процессы, рост, подвижность.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В данной работе мы исследуем характерное движение и осцилляции мембраны бактериальных клеток с помощью измерительной схемы зондового микроскопа "ФемтоСкан". При изменениях на поверхностном слое вследствие адсорбции частиц (в случае обнаружения) или при изменении поверхностного натяжения изменяется резонансная частота колебаний пьезокерамического биочипа, что может быть зарегистрировано схемой и преобразовано в количественный результат с помощью ПО "ФемтоСкан Онлайн". Контрольное измерение колебаний биочипа представлено на рис.1.
Параллельно с наблюдением бактерий в атомно-силовой микроскоп для их визуализации можно использовать метод микролинзовой микроскопии [10, 11]. Оптическая микроскопия ограничена дифракционным пределом, который удается преодолеть благодаря использованию линз микронного диаметра. На рис.4 представлено изображение калибровочного образца – поверхности микросхемы, полученное с помощью оптического микроскопа Axio Scope 40 Carl Zeiss и микролинзы диаметром 20 мкм из титаната бария, расположенной на поверхности образца.
ВЫВОДЫ
В наших исследованиях микролинзовая микроскопия позволяет исследовать образцы бактерий параллельно с зондовой микроскопией за счет использования установки для совмещенной зондовой, оптической и микролинзовой микроскопии. При этом микролинзовая микроскопия существенно сокращает требуемое время на поиск бактерий на подложке для последующих детальных измерений методами сканирующей зондовой микроскопии.
Часто для оценки состояния бактериальной клетки статического изображения недостаточно. Требуется проводить комплексное наблюдение во времени с применением набора методов. Для этого уверенно подходят атомно-силовая микроскопия, микролинзовая микроскопия и регистрация колебаний мембраны клетки с помощью микромеханической системы методам резонанса.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РНФ, проект № 20-12-00389, РФФИ, проект № 20-32-90036.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Morency-Potvin P., Schwartz D.N., Weinstein R.A. Antimicrobial stewardship: How the microbiology laboratory can right the ship. Clin. Microbiol. Rev. 2017, 30, 381–407. https://doi.org/10.1128/CMR.00066-16
Huber F., Lang H.P., Backmann N., Rimoldi D., Gerber C. Direct detection of a BRAF mutation in total RNA from melanoma cells using cantilever arrays. Nat Nanotechnol. 2013, 8(2), 125–129. https://doi.org/10.1038/nnano.2012.263
Etayash H., McGee A.R., Kaurac K., Thundat T. Nanomechanical sandwich assay for multiple cancer biomarkers in breast cancer cell-derived exosomes. Nanoscale, 2016, 8, 15137–15141. https://doi.org/10.1039/C6NR03478K
Duffy J., Padovani F., Brunetti G., Noy P., Certa U., Hegner M. Towards personalised rapid label free miRNA detection for cancer and liver injury diagnostics in cell lysates and blood based samples. Nanoscale, 2018, 10, 12797–12804. https://doi.org/10.1039/C8NR03604G
Longo G., Alonso-Sarduy L., Marques Rio L., Bizzini A., Trampuz A., Notz J., Dietler G., Kasas S. Rapid detection of bacterial resistance to antibiotics using AFM cantilevers as nanomechanical sensors. Nat. Nanotechnol., 2013, 8(7), 522–526. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.120
Kasas S., Ruggeri F.S., Benadiba C., Maillard C., Stupar P., Tournu H., Dietler G., Longo G. Detecting Nanoscale Vibrations as Signature of Life. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 378–381.
Mustazzolu A., Venturelli L., Dinarelli S., Brown K., Floto R.A., Dietler G., Fattorini L., Kasas S., Girasole M., Longo G. A Rapid Unraveling of the Activity and Antibiotic Susceptibility of Mycobacteria. Antimicrob. Agents. Chemother. 2019, 63. https://doi.org/10.1128/AAC.02194-18
Mertens J., Cuervo A., Carrascosa J.L. Nanomechanical detection of Escherichia coli infection by bacteriophage T7 using cantilever sensors. Nanoscale, 2019, 11, 17689. https://doi.org/10.1039/c 9nr05240b
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Senotrusova S.A. Microlens microscopy opens up new possibilities in the visualization of biological objects. Medicine and high technologies, 2021, 1, 51–55. https://doi.org/10.34219/2306-3645-2021-11-1-51-55
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Senotrusova S.A. Optical microscopy using microlenses. Nanoindustry, 2021, 14, 3–4, 22–25. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.3-4.184.187
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Отзывы читателей
