eng
Выпуск #1/2022
Т.А.Смирнова, З.С.Плиева, М.В.Зубашева, А.И.Ахметова, Ю.А.Смирнов, В.Г.Жуховицкий, И.В.Яминский
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ СПОР BACILLUS CEREUS
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ СПОР BACILLUS CEREUS
Просмотры: 1307
10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
Интерес к спорообразующим бактериям Bacillus cereus связан с их широкой распространенностью и способностью вызывать различные заболевания, главным образом желудочно-кишечного тракта. Споры патогенных микроорганизмов, в том числе и B. cereus, представляют большую проблему для медицины, фармакологии и пищевой промышленности из-за резистентности к различным факторам внешней среды. Свойства спор обусловлены их ультраструктурой. Базисная структура спор консервативна и состоит из экзоспориума, оболочки, внешней мембраны, кортекса, внутренней мембраны и сердцевины [1]. Однако наружные слои спор, включая экзоспориум, различаются у отдельных видов и штаммов, что позволяет сравнивать особенности их компонентов с помощью электронной микроскопии.
Интерес к спорообразующим бактериям Bacillus cereus связан с их широкой распространенностью и способностью вызывать различные заболевания, главным образом желудочно-кишечного тракта. Споры патогенных микроорганизмов, в том числе и B. cereus, представляют большую проблему для медицины, фармакологии и пищевой промышленности из-за резистентности к различным факторам внешней среды. Свойства спор обусловлены их ультраструктурой. Базисная структура спор консервативна и состоит из экзоспориума, оболочки, внешней мембраны, кортекса, внутренней мембраны и сердцевины [1]. Однако наружные слои спор, включая экзоспориум, различаются у отдельных видов и штаммов, что позволяет сравнивать особенности их компонентов с помощью электронной микроскопии.
Теги: bacillus cereus electron microscopy exosporium femtoscan online fourier-filtering negative contrast method spore-forming bacteria spores strain метод негативного контрастирования спорообразующие бактерии споры фемтоскан онлайн фурье-фильтрация штамм экзоспориум электронная микроскопия
Получено: 2.01.2022 г. | Принято: 11.01.2022 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
Научная статья
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ СПОР BACILLUS CEREUS
Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7121-635Х
З.С.Плиева1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-9765-8623
М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7330-7343
А.И.Ахметова2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2215-5420
В.Г.Жуховицкий1, 4, к.м.н., руководитель лаб., ORCID: 0000-0002-4653-2446
И.В.Яминский2, 3 д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В. Ломоносова, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Интерес к спорообразующим бактериям Bacillus cereus связан с их широкой распространенностью и способностью вызывать различные заболевания, главным образом желудочно-кишечного тракта. Споры патогенных микроорганизмов, в том числе и B. cereus, представляют большую проблему для медицины, фармакологии и пищевой промышленности из-за резистентности к различным факторам внешней среды. Свойства спор обусловлены их ультраструктурой. Базисная структура спор консервативна и состоит из экзоспориума, оболочки, внешней мембраны, кортекса, внутренней мембраны и сердцевины [1]. Однако наружные слои спор, включая экзоспориум, различаются у отдельных видов и штаммов, что позволяет сравнивать особенности их компонентов с помощью электронной микроскопии.
Ключевые слова: спорообразующие бактерии, Bacillus cereus, экзоспориум, штамм, споры, электронная микроскопия, ФемтоСкан Онлайн, фурье-фильтрация, метод негативного контрастирования
Для цитирования: Т.А.Смирнова, З.С.Плиева, М.В.Зубашева, А.И.Ахметова, Ю.А.Смирнов, В.Г.Жуховицкий, И.В.Яминский. Структурная организация поверхности спор Bacillus cereus. Наноиндустрия. 2022. Т. 15, № 1. С. 8–16. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
Received: 2.01.2022 | Accepted: 11.01.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
Original paper
STRUCTURAL ORGANISATION OF THE SURFACE OF BACILLUS CEREUS SPORES
T.A.Smirnova1, Doct. of Sci. (Biology), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-7121-635Х
Z.S.Plieva1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0001-9765-8623
M.V.Zubasheva1, Cand. of Sci. (Biology), Scientific Researcher, ORCID: 0000-0001-7330-7343 A.I.Akhmetova2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sci. (Medicine), Prof., Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-2215-5420 V.G.Zhukhpvitsky1, 4, Cand. of Sci. (Medicine), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0002-4653-2446 I.V.Yaminsky2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. The interest in the spore-forming bacteria Bacillus cereus is due to their widespread occurrence and their ability to cause various diseases, mainly of the gastrointestinal tract. Spores of pathogenic microorganisms, including B. cereus, pose a great challenge to medicine, pharmacology and food industry because of their resistance to various environmental factors. The properties of the spores are determined by their ultrastructure. The basic structure of spores is conservative and consists of the exosporium, shell, outer membrane, cortex, inner membrane and core [1]. However, the outer layers of the spores, including the exosporium, vary between species and strains, allowing the features of their components to be compared by electron microscopy.
Keywords: spore-forming bacteria, Bacillus cereus, exosporium, strain, spores, electron microscopy, FemtoScan Online, Fourier-filtering, negative contrast method
For citation: T.A.Smirnova, Z.S.Plieva, M.V.Zubasheva, A.I.Akhmetova, Yu.A.Smirnov, V.G.Zhukhovetsky, I.V.Yaminsky. Structural organisation of the surface of Bacillus cereus spores. Nanoindustry. 2022. V. 15, no. 1. РР. 8–16. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
ВВЕДЕНИЕ
Экзоспориум – структура, характерная для спор группы B. cerеus, B. thuringiensis, B. anthracis, состоит из наружного ворсинчатого слоя, внутреннего паракристаллического, гексагонально перфорированного базального слоя и содержит белки, липиды, полисахариды [2–4]. Экзоспориум имеет длинные выросты, способствующие адгезии спор [5]. Экзоспориум находится от оболочки на значительном расстоянии, например, у B. anthracis – 500 нм [3]. Электронно-прозрачная область между базальным слоем экзоспориума и оболочкой спор (промежуточное, экзоспориальное пространство) у некоторых штаммов содержит структуры, образующие дополнительные поверхностные слои. Экзоспориум играет важную роль в резистентности, адгезии, распространении и в прорастании спор. Экзоспориум представляет собой фильтр, который позволяет проникать индукторам прорастания – аланину или инозину, но не протеолитическим ферментам и антителам [6]. У спор мутанта B. cereus, имеющего повышенную устойчивость к лизоциму и измененную способность к прорастанию, образуется двойной экзоспориум [7]. Важным для структурных исследований экзоспориума является его естественная кристаллическая природа. Экзоспориум может быть использован как модель для создания самоорганизующихся надмолекулярных, наноразмерных структур. Показано, что основной белок базального слоя ExsY может собираться в упорядоченные двумерные структуры, которые имитируют экзоспориум. Самосборка, вероятно, играет важную роль в построении экзоспориума [8]. С помощью электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений ранее нами были получены данные о тонкой структуре экзоспориума эталонного штамма B. cerеus [9].
Представляло интерес провести изучение экзоспориума у спор штаммов различного происхождения, природных и клинических изолятов с помощью электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений. Исследуемые штаммы до настоящего времени не были изучены. Особое внимание уделено наружным структурам спор B. cereus (экзоспориум и экзоспориальное пространство) этих штаммов, их организации как элементов, обеспечивающих свойства поверхности. Целью настоящего исследования является определение параметров решетки базальной мембраны экзоспориума и сравнение поверхностных структур спор штаммов из различных экологических ниш.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и питательные среды
В работе использовали коллекционный эталонный штамм NCTC 8035 и природные штаммы (115\079, 131\079) B. cereus. Штаммы выращивали на агаризованном питательном бульоне LB при 28 °С в течение 96 ч. Клинические изоляты были получены от больных с язвенным колитом (ЯК) из Государственного научного центра колопроктологии им. А.Н. Рыжих МЗ РФ, обозначенные как B.сerеus SCCC 1208, В.cerеus SCCC 19/16. Исследовали также следующие штаммы: штамм 169 B. cereus, выделенный из отделяемого брюшной полости у больного с ЯК; штамм 177 B. cereus, выделенный из просветных фекалий; штамм 172 B. cereus, выделенный из просветных фекалий; штамм 214/18 B. cereus, выделенный из операционной раны пациента с ЯК; штамм 239/18 B. cereus, выделенный из крови пациента с ЯК и подтвержденным диагнозом сепсиса; штамм 223/18 B. cereus, выделенный из брюшной полости пациента с ЯК штамм 181 B. cereus, выделенный из операционной раны пациента с ЯК. Среда выращивания – кровяной агар.
Просвечивающая электронная микроскопия
Бактерии через 96 ч культивирования смывали с плотной питательной среды и отмывали дистиллированной водой. Для изучения спор методом негативного контрастирования суспензию спор наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, и окрашивали 1% водным раствором уранилацетата или 2% водным раствором молибдата аммония. Для получения ультратонких срезов образцы фиксировали по методу Ито-Карновски [10]. Затем материал фиксировали в 1% ОsО4 растворе на 0,2 М какодилатном буфере и в 1% растворе уранилацетата на 0,2 М малеатном буфере. Материал обезвоживали в спиртах с концентрациями 50°, 70°, 96°, 100°. Далее помещали в смесь 100° спирта со смолой LR White, а затем в чистую смолу LR White. Материал переносили в желатиновые капсулы, которые помещали в термостат при 56 °C. Срезы получали на ультратоме LKB III (LKB, Sweden) и контрастировали 1% раствором уранилацетата в 70° спирте и лимоннокислым свинцом. Негативно окрашенные споры и срезы изучали в электронном микроскопе JEM 2100 (Jeol, Japan) при ускоряющем напряжении 160 кВ. Анализ изображений проводился с помощью программного обеспечения "ФемтоСкан Онлайн" (Центр перспективных технологий, Москва, www.nanoscopy.ru) [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Методами негативного контрастирования и ультратонких срезов было проведено электронно-микроскопическое изучение спор эталонного, природных штаммов и клинических изолятов B. cereus. На рис.1–7 представлены зрелые споры эталонного штамма 8035, природных штаммов и клинических изолятов B. cereus. Эталонный штамм 8035 имеет характерную для B. cereus ультраструктуру (рис.1).
На поперечном срезе представлены следующие структуры: экзоспориум в виде электронно-плотного наружного слоя, электронно-прозрачное экзоспориальное пространство, отделяющее экзоспориум от споровой электронно-плотной оболочки, электронно-прозрачный кортекс, сердцевина в центре споры. Эти результаты дают общее представление о строении споры B. cereus. Все исследованные штаммы (природные и клинические изоляты) имели сходную базисную ультраструктуру, но и свои особенности. У споры природного штамма B.сerеus 131 на поперечном срезе в экзоспориальном пространстве обнаруживаются множественные мембранные включения, повторяющие ход экзоспориума (рис.2).
У клинического изолята B.сerеus 19 на продольном срезе видно, что спора находится на одном полюсе экзоспориума, свободно прилегающего чехла, а большая часть его внутреннего электронно-прозрачного пространства заполнена хаотично расположенными фрагментами мембранных структур (рис.3).
На поперечных срезах спор клинических изолятов видно, что экзоспориальное пространство содержит структуры, отсутствующие у спор эталонного штамма. На рис.4 a, b, c виден дополнительный слой второго экзоспориума у клинических изолятов 214, 177, 239.
Таким образом обнаружено, что поверхностные слои спор природных штаммов и клинических изолятов утолщены и, возможно, менее проницаемы, чем у эталонного штамма. Такая особенность может защищать спору от различных бактерицидных факторов. В случае природных штаммов это могут быть погодные воздействия, а клинические изоляты должны противостоять защитным антибактериальным механизмам хозяина. Эталонный штамм 8035, выращиваемый в лабораторных условиях, не подвергается таким воздействиям и имеет более упрощенную поверхность спор.
Методом негативного контрастирования было также проведено электронно-микроскопическое изучение спор клинических и природных изолятов. На рис.5, 6 представлены споры и их фрагменты, негативно контрастированные 2% молибдатом аммония. Ранее методом негативного контрастирования исследовали споры эталонного штамма 8035 [9].
Экзоспориум исследованных спор штаммов, как и у штамма 8035, выявлялся в виде электронно-прозрачного двуслойного мешка, окружающего электронно-плотную спору. Для выявления ультраструктуры исследовали периферическую область экзоспориума. На рис.5 представлены участки экзоспориума у природных штаммов B. сerеus 114 и 115 с хорошо различимыми ворсинчатым и базальными слоями, а также аналогичный участок экзоспориума у клинического изолята 239. На поверхности спор штаммов 114 и115 видны длинные споровые выросты.
При большом увеличении на всех снимках видна гексагональная упаковка субъединиц базальной мембраны. Однако структура этой мембраны видна не отчетливо.
Для получения четкой картины экзоспориума спор эталонного штамма 8035 ранее применили фурье-фильтрацию и получили свободное от шумов изображение, на котором видна гексагональная упаковка и отверстия. Аналогичная работа проведена с экзоспориумом штамма 239 (рис.6). Измерение периода рефлексов не выявило значительных изменений расстояния между порами в гексагональной упаковке экзоспориума штамма 239 по сравнению с эталонным штаммом: у штамма 8035 длина составляла 5,6 нм, 6,2 нм, 4,7 нм. На рис.6c длина составляет 5,2 нм, 5,5 нм, 5,8 нм.
Среднее значение одинаково для эталонного штамма и штамма 239–5,5 нм.
На рис.7 показан однослойный фрагмент экзоспориума клинического изолята B.сerеus 214, демонстрирующий сходство с экзоспориумом другого клинического изолята B.сerеus 239.
ВЫВОДЫ
В результате проведенного исследования выявлены общие и различные черты между эталонным штаммом и природными и клиническими изолятами. В частности, выявлены различия в поверхностных слоях спор природных штаммов и клинических изолятов – по сравнению с эталонным штаммом они утолщены и, видимо, лучше защищают споры от проникновения извне. Обнаружен дополнительный слой второго экзоспориума у клинических изолятов. С помощью фурье-фильтрации определены общие особенности в гексагональной упаковке экзоспориума – расстояние между порами одного слоя составляет в среднем 5,5 нм.
Полученные результаты могут быть использованы для понимания особенностей спор B.cereus из различных экологических ниш и их чувствительности к спороцидным факторам.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества №21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект №71108, договор 0071108.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Leggett M.J., McDonnell G., Denyer S.P., Setlow P., Maillard J. Bacterial spore structures and their protective role in biocide resistance. J. of Applied Microbiol. 2012, 113, 485–498. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05336.x
Ohye D.F., Murrell W.G. Exosporium and Spore Coat Formation in Bacillus cereus T. J. of Bacteriology. 1973, 115 (3), 1179-1190. https://doi.org/10.1128/jb.115.3.1179-1190.1973
Stewart G.C. The Exosporium Layer of Bacterial Spores: a Connection to the Environment and the Infected Host. Microbiol Mol Biol Re. v. 2015. , 79(4), 437–457. https://doi.org/10.1128/MMBR.00050-15
Matz L.L., Beaman T.C., Gerhardt P. Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus. J. Bacteriol. 1970, 101, 196–201. https://doi.org/10.1128/jb.101.1.196-201.1970
Plieva Z.S., Smirnova T.A., Zubasheva М.V., Smirnov Yu.A., Zhukovitskiy V.G., Akhmetova A.I., Yaminskiy I.V. The structure of the appendages on spores of bacillus cereus. Nanoindustry. 2020, 13(7-8), рр. 458–464. http://dx.doi.org/10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.458.464
Fazzini M.M., Schuch R., Fischetti V.A. A Novel Spore Protein, ExsM, Regulates Formation of the Exosporium in Bacillus cereus and Bacillus anthracis and Affects Spore Size and Shape. J. Bacteriol. 2010, 192(15), 4012–4021. https://doi.org/10.1128/JB.00197-10
Вall D.A., Taylor R., Todd S.J. et al. Structure of exosporium and sublayers of spores of the Bacillus cereus family revealed by electron crystallography. Mol. microbiol. 2008, 68(4) 947–958. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06206.x
Terry C., Jiang S., Radford D.S. et al. Molecular tiling on the surface of a bacterial spore – the exosporium of the Bacillus anthracis/cereus/thuringiensis group. Mol Microbiol. 2017, 104(4), pp. 539–552. https://doi.org/10.1111/mmi.13650
Plieva Z.S., Smirnova T.A., Zubasheva M.V., Smirnov Yu.A., Zhukhovitsky V.G., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Structure of the exosporium of Bacillus cereus spores. Nanoindustry. 2020, 13(7–8), pp. 426–432. https://doi.org/ 10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.426.432
Ito S., Karnovsky M. Formaldehide glutaraldehide fixatives containing trinitrocompound. J. Cell biol. 1969, 39, 168a–169a.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online software and visualization of nanoobjects in high resolution microscopy. Nanoindustry, 11 (6 (85)) (2018), pp. 414–416.
Декларация о конфликте интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Научная статья
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ СПОР BACILLUS CEREUS
Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7121-635Х
З.С.Плиева1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-9765-8623
М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7330-7343
А.И.Ахметова2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2215-5420
В.Г.Жуховицкий1, 4, к.м.н., руководитель лаб., ORCID: 0000-0002-4653-2446
И.В.Яминский2, 3 д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В. Ломоносова, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Интерес к спорообразующим бактериям Bacillus cereus связан с их широкой распространенностью и способностью вызывать различные заболевания, главным образом желудочно-кишечного тракта. Споры патогенных микроорганизмов, в том числе и B. cereus, представляют большую проблему для медицины, фармакологии и пищевой промышленности из-за резистентности к различным факторам внешней среды. Свойства спор обусловлены их ультраструктурой. Базисная структура спор консервативна и состоит из экзоспориума, оболочки, внешней мембраны, кортекса, внутренней мембраны и сердцевины [1]. Однако наружные слои спор, включая экзоспориум, различаются у отдельных видов и штаммов, что позволяет сравнивать особенности их компонентов с помощью электронной микроскопии.
Ключевые слова: спорообразующие бактерии, Bacillus cereus, экзоспориум, штамм, споры, электронная микроскопия, ФемтоСкан Онлайн, фурье-фильтрация, метод негативного контрастирования
Для цитирования: Т.А.Смирнова, З.С.Плиева, М.В.Зубашева, А.И.Ахметова, Ю.А.Смирнов, В.Г.Жуховицкий, И.В.Яминский. Структурная организация поверхности спор Bacillus cereus. Наноиндустрия. 2022. Т. 15, № 1. С. 8–16. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
Received: 2.01.2022 | Accepted: 11.01.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
Original paper
STRUCTURAL ORGANISATION OF THE SURFACE OF BACILLUS CEREUS SPORES
T.A.Smirnova1, Doct. of Sci. (Biology), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-7121-635Х
Z.S.Plieva1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0001-9765-8623
M.V.Zubasheva1, Cand. of Sci. (Biology), Scientific Researcher, ORCID: 0000-0001-7330-7343 A.I.Akhmetova2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sci. (Medicine), Prof., Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-2215-5420 V.G.Zhukhpvitsky1, 4, Cand. of Sci. (Medicine), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0002-4653-2446 I.V.Yaminsky2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. The interest in the spore-forming bacteria Bacillus cereus is due to their widespread occurrence and their ability to cause various diseases, mainly of the gastrointestinal tract. Spores of pathogenic microorganisms, including B. cereus, pose a great challenge to medicine, pharmacology and food industry because of their resistance to various environmental factors. The properties of the spores are determined by their ultrastructure. The basic structure of spores is conservative and consists of the exosporium, shell, outer membrane, cortex, inner membrane and core [1]. However, the outer layers of the spores, including the exosporium, vary between species and strains, allowing the features of their components to be compared by electron microscopy.
Keywords: spore-forming bacteria, Bacillus cereus, exosporium, strain, spores, electron microscopy, FemtoScan Online, Fourier-filtering, negative contrast method
For citation: T.A.Smirnova, Z.S.Plieva, M.V.Zubasheva, A.I.Akhmetova, Yu.A.Smirnov, V.G.Zhukhovetsky, I.V.Yaminsky. Structural organisation of the surface of Bacillus cereus spores. Nanoindustry. 2022. V. 15, no. 1. РР. 8–16. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.8.16
ВВЕДЕНИЕ
Экзоспориум – структура, характерная для спор группы B. cerеus, B. thuringiensis, B. anthracis, состоит из наружного ворсинчатого слоя, внутреннего паракристаллического, гексагонально перфорированного базального слоя и содержит белки, липиды, полисахариды [2–4]. Экзоспориум имеет длинные выросты, способствующие адгезии спор [5]. Экзоспориум находится от оболочки на значительном расстоянии, например, у B. anthracis – 500 нм [3]. Электронно-прозрачная область между базальным слоем экзоспориума и оболочкой спор (промежуточное, экзоспориальное пространство) у некоторых штаммов содержит структуры, образующие дополнительные поверхностные слои. Экзоспориум играет важную роль в резистентности, адгезии, распространении и в прорастании спор. Экзоспориум представляет собой фильтр, который позволяет проникать индукторам прорастания – аланину или инозину, но не протеолитическим ферментам и антителам [6]. У спор мутанта B. cereus, имеющего повышенную устойчивость к лизоциму и измененную способность к прорастанию, образуется двойной экзоспориум [7]. Важным для структурных исследований экзоспориума является его естественная кристаллическая природа. Экзоспориум может быть использован как модель для создания самоорганизующихся надмолекулярных, наноразмерных структур. Показано, что основной белок базального слоя ExsY может собираться в упорядоченные двумерные структуры, которые имитируют экзоспориум. Самосборка, вероятно, играет важную роль в построении экзоспориума [8]. С помощью электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений ранее нами были получены данные о тонкой структуре экзоспориума эталонного штамма B. cerеus [9].
Представляло интерес провести изучение экзоспориума у спор штаммов различного происхождения, природных и клинических изолятов с помощью электронной микроскопии и компьютерного анализа изображений. Исследуемые штаммы до настоящего времени не были изучены. Особое внимание уделено наружным структурам спор B. cereus (экзоспориум и экзоспориальное пространство) этих штаммов, их организации как элементов, обеспечивающих свойства поверхности. Целью настоящего исследования является определение параметров решетки базальной мембраны экзоспориума и сравнение поверхностных структур спор штаммов из различных экологических ниш.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и питательные среды
В работе использовали коллекционный эталонный штамм NCTC 8035 и природные штаммы (115\079, 131\079) B. cereus. Штаммы выращивали на агаризованном питательном бульоне LB при 28 °С в течение 96 ч. Клинические изоляты были получены от больных с язвенным колитом (ЯК) из Государственного научного центра колопроктологии им. А.Н. Рыжих МЗ РФ, обозначенные как B.сerеus SCCC 1208, В.cerеus SCCC 19/16. Исследовали также следующие штаммы: штамм 169 B. cereus, выделенный из отделяемого брюшной полости у больного с ЯК; штамм 177 B. cereus, выделенный из просветных фекалий; штамм 172 B. cereus, выделенный из просветных фекалий; штамм 214/18 B. cereus, выделенный из операционной раны пациента с ЯК; штамм 239/18 B. cereus, выделенный из крови пациента с ЯК и подтвержденным диагнозом сепсиса; штамм 223/18 B. cereus, выделенный из брюшной полости пациента с ЯК штамм 181 B. cereus, выделенный из операционной раны пациента с ЯК. Среда выращивания – кровяной агар.
Просвечивающая электронная микроскопия
Бактерии через 96 ч культивирования смывали с плотной питательной среды и отмывали дистиллированной водой. Для изучения спор методом негативного контрастирования суспензию спор наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, и окрашивали 1% водным раствором уранилацетата или 2% водным раствором молибдата аммония. Для получения ультратонких срезов образцы фиксировали по методу Ито-Карновски [10]. Затем материал фиксировали в 1% ОsО4 растворе на 0,2 М какодилатном буфере и в 1% растворе уранилацетата на 0,2 М малеатном буфере. Материал обезвоживали в спиртах с концентрациями 50°, 70°, 96°, 100°. Далее помещали в смесь 100° спирта со смолой LR White, а затем в чистую смолу LR White. Материал переносили в желатиновые капсулы, которые помещали в термостат при 56 °C. Срезы получали на ультратоме LKB III (LKB, Sweden) и контрастировали 1% раствором уранилацетата в 70° спирте и лимоннокислым свинцом. Негативно окрашенные споры и срезы изучали в электронном микроскопе JEM 2100 (Jeol, Japan) при ускоряющем напряжении 160 кВ. Анализ изображений проводился с помощью программного обеспечения "ФемтоСкан Онлайн" (Центр перспективных технологий, Москва, www.nanoscopy.ru) [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Методами негативного контрастирования и ультратонких срезов было проведено электронно-микроскопическое изучение спор эталонного, природных штаммов и клинических изолятов B. cereus. На рис.1–7 представлены зрелые споры эталонного штамма 8035, природных штаммов и клинических изолятов B. cereus. Эталонный штамм 8035 имеет характерную для B. cereus ультраструктуру (рис.1).
На поперечном срезе представлены следующие структуры: экзоспориум в виде электронно-плотного наружного слоя, электронно-прозрачное экзоспориальное пространство, отделяющее экзоспориум от споровой электронно-плотной оболочки, электронно-прозрачный кортекс, сердцевина в центре споры. Эти результаты дают общее представление о строении споры B. cereus. Все исследованные штаммы (природные и клинические изоляты) имели сходную базисную ультраструктуру, но и свои особенности. У споры природного штамма B.сerеus 131 на поперечном срезе в экзоспориальном пространстве обнаруживаются множественные мембранные включения, повторяющие ход экзоспориума (рис.2).
У клинического изолята B.сerеus 19 на продольном срезе видно, что спора находится на одном полюсе экзоспориума, свободно прилегающего чехла, а большая часть его внутреннего электронно-прозрачного пространства заполнена хаотично расположенными фрагментами мембранных структур (рис.3).
На поперечных срезах спор клинических изолятов видно, что экзоспориальное пространство содержит структуры, отсутствующие у спор эталонного штамма. На рис.4 a, b, c виден дополнительный слой второго экзоспориума у клинических изолятов 214, 177, 239.
Таким образом обнаружено, что поверхностные слои спор природных штаммов и клинических изолятов утолщены и, возможно, менее проницаемы, чем у эталонного штамма. Такая особенность может защищать спору от различных бактерицидных факторов. В случае природных штаммов это могут быть погодные воздействия, а клинические изоляты должны противостоять защитным антибактериальным механизмам хозяина. Эталонный штамм 8035, выращиваемый в лабораторных условиях, не подвергается таким воздействиям и имеет более упрощенную поверхность спор.
Методом негативного контрастирования было также проведено электронно-микроскопическое изучение спор клинических и природных изолятов. На рис.5, 6 представлены споры и их фрагменты, негативно контрастированные 2% молибдатом аммония. Ранее методом негативного контрастирования исследовали споры эталонного штамма 8035 [9].
Экзоспориум исследованных спор штаммов, как и у штамма 8035, выявлялся в виде электронно-прозрачного двуслойного мешка, окружающего электронно-плотную спору. Для выявления ультраструктуры исследовали периферическую область экзоспориума. На рис.5 представлены участки экзоспориума у природных штаммов B. сerеus 114 и 115 с хорошо различимыми ворсинчатым и базальными слоями, а также аналогичный участок экзоспориума у клинического изолята 239. На поверхности спор штаммов 114 и115 видны длинные споровые выросты.
При большом увеличении на всех снимках видна гексагональная упаковка субъединиц базальной мембраны. Однако структура этой мембраны видна не отчетливо.
Для получения четкой картины экзоспориума спор эталонного штамма 8035 ранее применили фурье-фильтрацию и получили свободное от шумов изображение, на котором видна гексагональная упаковка и отверстия. Аналогичная работа проведена с экзоспориумом штамма 239 (рис.6). Измерение периода рефлексов не выявило значительных изменений расстояния между порами в гексагональной упаковке экзоспориума штамма 239 по сравнению с эталонным штаммом: у штамма 8035 длина составляла 5,6 нм, 6,2 нм, 4,7 нм. На рис.6c длина составляет 5,2 нм, 5,5 нм, 5,8 нм.
Среднее значение одинаково для эталонного штамма и штамма 239–5,5 нм.
На рис.7 показан однослойный фрагмент экзоспориума клинического изолята B.сerеus 214, демонстрирующий сходство с экзоспориумом другого клинического изолята B.сerеus 239.
ВЫВОДЫ
В результате проведенного исследования выявлены общие и различные черты между эталонным штаммом и природными и клиническими изолятами. В частности, выявлены различия в поверхностных слоях спор природных штаммов и клинических изолятов – по сравнению с эталонным штаммом они утолщены и, видимо, лучше защищают споры от проникновения извне. Обнаружен дополнительный слой второго экзоспориума у клинических изолятов. С помощью фурье-фильтрации определены общие особенности в гексагональной упаковке экзоспориума – расстояние между порами одного слоя составляет в среднем 5,5 нм.
Полученные результаты могут быть использованы для понимания особенностей спор B.cereus из различных экологических ниш и их чувствительности к спороцидным факторам.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества №21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект №71108, договор 0071108.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Leggett M.J., McDonnell G., Denyer S.P., Setlow P., Maillard J. Bacterial spore structures and their protective role in biocide resistance. J. of Applied Microbiol. 2012, 113, 485–498. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05336.x
Ohye D.F., Murrell W.G. Exosporium and Spore Coat Formation in Bacillus cereus T. J. of Bacteriology. 1973, 115 (3), 1179-1190. https://doi.org/10.1128/jb.115.3.1179-1190.1973
Stewart G.C. The Exosporium Layer of Bacterial Spores: a Connection to the Environment and the Infected Host. Microbiol Mol Biol Re. v. 2015. , 79(4), 437–457. https://doi.org/10.1128/MMBR.00050-15
Matz L.L., Beaman T.C., Gerhardt P. Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus. J. Bacteriol. 1970, 101, 196–201. https://doi.org/10.1128/jb.101.1.196-201.1970
Plieva Z.S., Smirnova T.A., Zubasheva М.V., Smirnov Yu.A., Zhukovitskiy V.G., Akhmetova A.I., Yaminskiy I.V. The structure of the appendages on spores of bacillus cereus. Nanoindustry. 2020, 13(7-8), рр. 458–464. http://dx.doi.org/10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.458.464
Fazzini M.M., Schuch R., Fischetti V.A. A Novel Spore Protein, ExsM, Regulates Formation of the Exosporium in Bacillus cereus and Bacillus anthracis and Affects Spore Size and Shape. J. Bacteriol. 2010, 192(15), 4012–4021. https://doi.org/10.1128/JB.00197-10
Вall D.A., Taylor R., Todd S.J. et al. Structure of exosporium and sublayers of spores of the Bacillus cereus family revealed by electron crystallography. Mol. microbiol. 2008, 68(4) 947–958. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06206.x
Terry C., Jiang S., Radford D.S. et al. Molecular tiling on the surface of a bacterial spore – the exosporium of the Bacillus anthracis/cereus/thuringiensis group. Mol Microbiol. 2017, 104(4), pp. 539–552. https://doi.org/10.1111/mmi.13650
Plieva Z.S., Smirnova T.A., Zubasheva M.V., Smirnov Yu.A., Zhukhovitsky V.G., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Structure of the exosporium of Bacillus cereus spores. Nanoindustry. 2020, 13(7–8), pp. 426–432. https://doi.org/ 10.22184/1993-8578.2020.13.7-8.426.432
Ito S., Karnovsky M. Formaldehide glutaraldehide fixatives containing trinitrocompound. J. Cell biol. 1969, 39, 168a–169a.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online software and visualization of nanoobjects in high resolution microscopy. Nanoindustry, 11 (6 (85)) (2018), pp. 414–416.
Декларация о конфликте интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Отзывы читателей
