ПРАКТИКУМ ПО ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ ФИЗИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА МГУ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА
Сканирующая зондовая микроскопия является простым методом для изучения материалов, в том числе полимеров и биополимеров с нанометровым разрешением в жидкости и на воздухе. Зондовая микроскопия позволяет визуализировать поверхностную структуру образцов, оценить их конформацию, адгезию, адсорбцию на различных подложках. При этом метод не требует длительной пробоподготовки, нужно лишь разместить образец на атомно гладкой подложке, какими являются, например, графит и слюда. Навык работы с зондовым микроскопом и умение обрабатывать полученные данные являются важным этапом в программе обучения молодых специалистов. Для развития этих компетенций на физическом факультете МГУ постоянно совершенствуется и модернизируется практикум по зондовой микроскопии. Практикум представляет собой восемь лабораторных работ по ключевым тематикам и включает обучение как базовым, так и углубленным навыкам по работе с микроскопом, по обработке и интерпретации данных зондовой микроскопии.
Научная статья
ПРАКТИКУМ ПО ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ ФИЗИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА МГУ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
А.И.Ахметова1, 2, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Аннотация. Сканирующая зондовая микроскопия является простым методом для изучения материалов, в том числе полимеров и биополимеров с нанометровым разрешением в жидкости и на воздухе. Зондовая микроскопия позволяет визуализировать поверхностную структуру образцов, оценить их конформацию, адгезию, адсорбцию на различных подложках. При этом метод не требует длительной пробоподготовки, нужно лишь разместить образец на атомно гладкой подложке, какими являются, например, графит и слюда. Навык работы с зондовым микроскопом и умение обрабатывать полученные данные являются важным этапом в программе обучения молодых специалистов. Для развития этих компетенций на физическом факультете МГУ постоянно совершенствуется и модернизируется практикум по зондовой микроскопии. Практикум представляет собой восемь лабораторных работ по ключевым тематикам и включает обучение как базовым, так и углубленным навыкам по работе с микроскопом, по обработке и интерпретации данных зондовой микроскопии.
Ключевые слова: сканирующая зондовая микроскопия, полимеры, биополимеры, трехмерная визуализация, FemtoScan, сканирующая туннельная микроскопия
Для цитирования: И.В. Яминский, А.И. Ахметова. Практикум по зондовой микроскопии физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. НАНОИНДУСТРИЯ. 2022. Т. 15, № 6. С. 328–332. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.6.328.332
Received: 27.09.2022 | Accepted: 30.09.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.6.328.332
Original paper
PROBE MICROSCOPY WORKSHOP AT THE PHYSICAL DEPARTMENT OF LOMONOSOV MOSCOW STATE UNIVERSITY
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
A.I.Akhmetova1, 2, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Abstract. Scanning probe microscopy is a simple method to study materials, including polymers and biopolymers at nanometre resolution in liquid and air. Probe microscopy allows of visualizing the surface structure of samples, assess their conformation, adhesion and adsorption on different substrates. The method does not require time-consuming sample preparation, it is sufficient t to just place a sample on an atomically smooth substrate, such as graphite and mica. Probe microscope skills and ability to process the data present an important step in the training programme for young professionals. To develop these competences, the Physical department of MSU is continuously improving and upgrading the probe microscopy workshop. The workshop is composed of eight laboratory work sessions on key topics and includes training in both basic and advanced skills in microscope handling, processing and interpretation of the probe microscopy data.
Keywords: scanning probe microscopy, polymers, biopolymers, 3D imaging, FemtoScan, scanning tunnelling microscopy
For citation: I.V. Yaminsky, A.I. Akhmetova. Probe microscopy workshop at the physical department of Lomonosov Moscow State university. NANOINDUSTRY. 2022. V. 15, no. 6. PP. 328–332. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.6.328.332
ВВЕДЕНИЕ
С момента своего изобретения сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ) использовался во многих сферах материаловедения и микроэлектроники для определения характеристик твердых поверхностей, визуализации топографии микросхем и электронных устройств. Особый интерес представляют исследования биологических объектов с помощью СЗМ [1]. Неинвазивный характер метода делает его идеальным инструментом для изучения живых систем. Основная задача его использования при изучении биологических объектов заключается в том, что при этом необходимо поддерживать минимальное воздействие зонда на поверхность изучаемого объекта.
В настоящее время лабораторный практикум состоит из восьми лабораторных работ по ключевым тематикам и включает начальное знакомство с методами получения и обработки изображений, а также последующее детальное изучение четырех образцов: графита, полимера (блок-сополимера бутадиена-стирола), нуклеиновых кислот и бактериальных клеток:
Основы работы на сканирующем зондовом микроскопе;
Обработка изображений сканирующей зондовой микроскопии;
Сканирующая зондовая микроскопия: получение трехмерных изображений. Часть 1;
Сканирующая зондовая микроскопия: получение трехмерных изображений. Часть 2;
Сканирующая туннельная микроскопия. Визуализация атомной решетки графита;
Сканирующая зондовая микроскопия блок-сополимеров;
Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот;
Сканирующая зондовая микроскопия бактериальных клеток.
В лабораторных работах для управления микроскопом и анализа получаемых данных используется современное программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [2]. Все лабораторные задачи имеют практическую направленность. Так, оценка морфологических признаков бактериальных клеток особенно важна при исследовании влияния биоцидных препаратов на клетки. Основные морфологические характеристики бактерии можно получить с помощью встроенных алгоритмов. При этом при выделении на изображении отдельных бактериальных клеток можно использовать различные способы, например, пороговую фильтрацию. На рис.1 представлено АСМ-изображение кишечной палочки, клетки фиксированы формалином в течение 15 мин, после чего отмыты от формалина и PBS и нанесены на поверхность слюды.
Полученные характеристики бактериальной клетки:
объем бактерии = 0,226 мкм3;
форм-фактор 1 = 0,08 (отношение радиуса окружности эквивалентной площади к радиусу окружности эквивалентного периметра), что свидетельствует об изрезанности периметра объекта. Для круглого объекта форм-фактор 1 равен единице;
форм-фактор 2 = 1,4 (отношение удвоенной длины скелета объекта к его периметру) характеризует продолговатость формы бактерии;
средняя высота = 131 нм (среднее значение высот на всех строках, занимаемых объектом);
среднеквадратичное значение шероховатости поверхности 12 нм.
Зондовая микроскопия дает полезную информацию о морфометрических характеристиках эритроцитов, которую можно использовать в диагностических целях. В частности, объем эритроцитов является важным параметром, который характеризует снабжение кислородом. Отклонение параметра от нормы может привести к гипоксии.
С помощью программного обеспечения, построив сечение и 3D-вид, можно рассчитать морфометрические параметры эритроцита [3]. На рис.2 представлен эритроцит с диаметром 8 мкм, высотой 500 нм, объем составляет 12 мкм3.
Форма, жесткость и шероховатость мембраны также имеют важное значение для диагностики патологий. В работе [4] с помощью АСМ исследовались свежевыделенные эритроциты от женщин с ранней потерей беременности (EPL), их эритроциты отличались как по величине шероховатости, так и по модулю Юнга, а также демонстрировали тенденцию к снижению морфометрических параметров клеток (размера клеток и шероховатости поверхности) и эластичности мембраны по сравнению со значениями для небеременных и здоровых беременных. Ускоренное старение эритроцитов выражалось в более раннем появлении клеток спикулярной и шаровидной формы, уменьшении шероховатости и эластичности мембраны с возрастной эволюцией.
Таким образом, в рамках практикума студенты получают не только полезные навыки по работе с микроскопом, но и учатся анализировать образцы с медицинской точки зрения. Лабораторные работы выполняют как бакалавры, так и магистры. С описаниями лабораторных работ можно подробно ознакомиться на сайте МГУ имени М.В.Ломоносова [5]. В настоящее время в разработке находится описание задачи лабораторного практикума "Атомно-силовая микроскопия: определение персистентной длины полимеров и биополимеров". Организация работы студентов в практикуме, включая запись на задачи, хранение результатов работ, расписание, осуществляется с помощью портала c авторизуемым и идентифицируемым доступом: практикум лаборатории СЗМ [6]. Портал построен на базе свободно распространяемой системы с открытым исходным кодом Moodle.
Оборудование практикума современным микроскопом позволяет проводить практические занятия на существенно более высоком уровне, и одним из наиболее подходящих вариантов, как по техническим характеристикам, так и по удобству использования, является многофункциональный сканирующий зондовый микроскоп "ФемтоСкан". Он является многофункциональным сканирующим зондовым микроскопом, в котором впервые в мире реализована технология дистанционного управления прибором и анализа данных через сеть Интернет. Это позволяет осуществлять полномасштабные измерения с любого компьютера, подключенного к локальной сети или сети Интернет, при этом неограниченное количество санкционированных сетевых пользователей могут иметь доступ к данным эксперимента в реальном масштабе времени и осуществлять самостоятельные анализ, обработку и построение трехмерных изображений.
При полноценной параллельной работе практикума, когда возможно одновременное выполнение всех лабораторных работ практикума в режимах онлайн или офлайн, количество микроскопов должно совпадать с числом лабораторных работ. В этом случае каждый из микроскопов готов для наблюдения конкретного заранее выбранного и установленного образца. При последовательной работе практикума оптимальное количество микроскопов – один, а лучше как минимум два. В этом случае переход с одного исследования на другое не будет занимать дополнительного времени.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект № 71108, договор 0071108. Работа выполнена при содействии компании ООО "Эндор" (Москва).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kuznetsov Y., McPherson A. Atomic Force Microscopy in Imaging of Viruses and Virus-Infected Cells. MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, June 2011, PP. 268–285. https://doi.org/10.1128/MMBR.00041-10
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. Construction, processing and analysis of three-dimensional images in biomedical scanning probe microscopy // NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14, no. 7–8. PP. 430–433. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.7-8.430.433
Sinitsyna O.V., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of erythrocytes: new diagnostic possibilities // Medicine and High Technologies. 2022. Vol. 1. PP. 9–12. https://doi.org/10.34219/2306-3645-2022-12-1-9-12
Langari A., Strijkova V., Komsa-Penkova R. et al. Morphometric and Nanomechanical Features of Erythrocytes Characteristic of Early Pregnancy Loss. Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23. P. 4512.
Электронный ресурс: http://nano.msu.ru/education/systems/courses/IV/practical
Электронный ресурс: http://learn.nanoscopy.ru