3D-ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Эритроциты являются одним из любимых объектов исследования в зондовой микроскопии. Во-первых, они легкодоступны, не требуют долгой и сложной пробоподготовки и, что самое главное, изобилуют отличительными особенностями, которые можно применять в клинической диагностике. Когда эритроциты циркулируют в крови, им необходимо проходить через узкие просветы капилляров, намного меньшие, чем размер их собственного поперечного сечения. Упругие свойства мембраны эритроцитов позволяют им проходить по кровяному руслу и доставлять необходимые вещества. Отношение площади поверхности к объему, вязкость цитоплазмы и внутренняя деформируемость мембран влияют на способность эритроцитов трансформироваться и проходить через узкие промежутки. Поэтому морфологические, структурные и физические характеристики клеток крови приобретают все более важное значение при исследовании различных заболеваний или оценке риска их развития.
Научная статья
3D-ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДАМИ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
А.А.Трухова1, студент, ORCID: 0000-0002-1695-287X
А.И.Ахметова1, 2, мл. науч. сотр., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф. МГУ имени М.В. Ломоносова, генеральный директор Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Эритроциты являются одним из любимых объектов исследования в зондовой микроскопии. Во-первых, они легкодоступны, не требуют долгой и сложной пробоподготовки и, что самое главное, изобилуют отличительными особенностями, которые можно применять в клинической диагностике. Когда эритроциты циркулируют в крови, им необходимо проходить через узкие просветы капилляров, намного меньшие, чем размер их собственного поперечного сечения. Упругие свойства мембраны эритроцитов позволяют им проходить по кровяному руслу и доставлять необходимые вещества. Отношение площади поверхности к объему, вязкость цитоплазмы и внутренняя деформируемость мембран влияют на способность эритроцитов трансформироваться и проходить через узкие промежутки. Поэтому морфологические, структурные и физические характеристики клеток крови приобретают все более важное значение при исследовании различных заболеваний или оценке риска их развития.
Ключевые слова: эритроциты, эхиноциты, сканирующая зондовая микроскопия, бионаноскопия
Для цитирования: А.А. Трухова, А.И. Ахметова, И.В. Яминский. 3D-визуализация эритроцитов методами атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. Т. 16, № 3–4. С. 180–184. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2023.16.3-4.180.184
Received: 29.04.2023 | Accepted: 2.05.2023 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.3-4.180.184
Original paper
3D VISUALIZATION OF ERYTHROCYTES
BY ATOMIC FORCE MICROSCOPY
A.A.Truhova1, Student, ORCID: 0000-0002-1695-287X
A.I.Akhmetova1, 2, Junior Researcher, Leading Specialist, ORCID: 0000-0002-5115-8030
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director of Advanced Technologies Center, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Erythrocytes are one of the favorite objects of study in probe microscopy. First, they are easily accessible, do not require long and complex sample preparation, and, most importantly, they are replete with distinctive features that can be used in clinical diagnostics. When red blood cells circulate in the blood, they need to pass through narrow capillary openings much smaller than their own cross-sectional size. The elastic properties of the membrane allow it to pass through the bloodstream and deliver the necessary substances. The ratio of surface area to volume, the viscosity of the cytoplasm, and the internal deformability of membranes affect the ability of red blood cells to transform and pass through narrow spaces. Therefore, the morphological, structural and physical characteristics of blood cells are becoming increasingly important in the study of various diseases or in assessing the risk of their development.
Keywords: erythrocytes, scanning probe microscopy, bionanoscopy
For citation: A.A. Truhova, A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky. 3D visualization of erythrocytes by atomic force microscopy. NANOINDUSTRY. 2023. V. 16, no. 3–4. PP. 180–184. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.3-4.180.184.
ВВЕДЕНИЕ
Атомно-силовая микроскопия зарекомендовала себя как отличный инструмент для исследования структурных и морфологических особенностей эритроцитов. Применительно к эритроцитам атомно-силовая микроскопия позволяет получать ряд важных характеристик клеток, многие из которых автоматически рассчитываются в программном обеспечении. С помощью АСМ можно получить морфометрический портрет клеток крови [1].
АСМ позволяет исследовать морфологические, наноструктурные, цитоскелетные и механические свойства эритроцитов, подвергшихся воздействию различных физических и химических факторов, а именно гемина, ионов цинка и длительному хранению [2]. На основании полученных экспериментальных данных был выделен комплекс важных биомаркеров, определяющих состояние клеток крови. Методами атомно-силовой микроскопии исследовали повреждающее действие солей кадмия на мембрану эритроцитов [3].
В работе [4] рассматривались эритроциты больных мегалобластной анемией (МА) с гемолизом (разрушение эритроцитов с выбросом гемоглобина в плазму крови): средняя шероховатость клеточной поверхности и площадь поверхности у опытной группы были значительно ниже, чем в контроле, а значение MCV у пациентов с МА было выше, чем у здоровых людей, что означает значительное снижение отношения площади поверхности к объему и снижению деформируемости. Такие эритроциты не могут выдерживать напряжения сдвига в процессе артериального кровообращения. Исследователями было выдвинуто предположение, что пониженная деформируемость клеток препятствует сохранению целостности клеток при микроциркуляции и в конечном итоге приводит к гемолизу.
В работе [5] оценивали морфологию эритроцитов и биохимические показатели у четырех групп: здоровые люди, люди с преддиабетом (PDG), с метаболическим синдромом (MSG) и группа с сахарным диабетом (DMG). Оценивались следующие морфологические параметры: высота, соотношение осей, глубина вогнутости диска, толщина, которые также связали с возрастом, значениями уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), триглицеридов, индексом массы тела, соотношением талии и бедер и отсутствием физической активности.
С помощью АСМ показали, что эритроциты серповидной формы имеют более шероховатую поверхность и большую жесткость, чем нормальные эритроциты [6].
Учитывая вышеупомянутые исследования, можно выделить следующие параметры:
MCV – mean cell volume, средний объем одного эритроцита;
шероховатость поверхности мембраны – выделяют среднюю Ra и среднеквадратичную Rq;
деформируемость – отношение площади поверхности к объему.
Коэффициент уплощенности клеток (Q) – отношение площади проекции к высоте. Этот коэффициент характеризует степень пластичности клеток [7].
Все вышеуказанные параметры хорошо исследуются с помощью АСМ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В рамках данной работы исследовались эритроциты человека с помощью АСМ на воздухе в контактном режиме на поверхности покровного стекла, кантилевер марки CSG10. Атомно-силовая микроскопия выполнялась на зондовом микроскопе "ФемтоСкан". Время съемки кадра около 8 мин.
Обработка результатов проводилась в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн", которое позволяет создавать трехмерные изображения, строить контурную длину, проводить фильтрацию, обработку изображений и выполнять необходимые количественные вычисления: площадь, объем, периметр, наибольшую высоту, шероховатость объекта [8, 9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получены 3D-изображения эритроцитов в течение нескольких недель после перенесенного заболевания коронавирусной инфекцией (рис.1, 2), далее их сравнили с образцом от здорового человека (рис.3).
Все клетки имеют овальную форму, отсутствуют клетки с формой двояковогнутого диска, все клетки округлые, морфология поверхности имеет характерный рельеф с выпячиваниями средней высотой около 100–150 нм.
Общий размер клеток по сравнению с обычным портретом эритроцитов в АСМ отличается – уменьшается общая площадь клеток и периметр, но увеличивается объем (средние значения по шести клеткам для каждого случая приведены в табл.1).
На рис.3 представлено изображение эритроцитов здорового донора.
ВЫВОДЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Почти все клетки в исследуемом образце находятся в форме эхиноцитов, хотя в образцах клеток от здорового донора количество эхиноцитов в аналогичном поле зрения минимально или не наблюдается вовсе. Скорее всего, трансформация в эхиноциты происходит в процессе пробоподготовки, можно предположить, что эритроциты чувствительны к изменениям среды и поэтому изменения происходят быстро в процессе взятия мазка и высыхания образца на покровном стекле. У здоровых доноров этот процесс протекает гораздо медленнее, клетки сохраняют форму двояковогнутого диска.
В работе [10] исследовали кровь больных COVID19, было показано, что в крови 80,6% больных как при поступлении, так и при выписке наблюдалась выраженная трансформация части эритроцитов в эхиноциты, доля эхиноцитов у больных составляла при поступлении в клинику 17,9±3,6% от общего числа наблюдавшихся эритроцитов, при выписке уменьшалась до 12,1±2,1%.
С помощью атомно-силовой микроскопии можно увидеть морфологические и структурные особенности клеток крови. Особенно полезно, когда эти параметры можно связать с конкретными факторами или диагнозом.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы благодарны Фонду содействия инновациям (проект № 71108), работа А.И.Ахметовой поддержана РНФ (проект № 23-74-30003).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Sinitsyna O.V., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of erythrocytes: new diagnostic possibilities. Medicine and High Technology 1 (2022), PP. 9–12. https://doi.org/10.34219/2306-3645-2022-12-1-9-12
Sergunova V., Leesment S., Kozlov A., Inozemtsev V., Platitsina P., Lyapunova S., Onufrievich A., Polyakov V., Sherstyukova E. Investigation of Red Blood Cells by Atomic Force Microscopy. Sensors (Basel). 2022 Mar 7;22(5): 2055. https://doi.org/10.3390/s22052055
Demchenkov E.L., Nagdalian A.A., Budkevich R.O., Oboturova N.P., Okolelova A.I. Usage of atomic force microscopy for detection of the damaging effect of CdCl2 on red blood cells membrane. Ecotoxicol Environ Saf. 2021. 208: 111683. https://doi.org/10.1016/j.ecoen. v. 2020. 111683
Wu Q., Liu J., Xu X., Huang B., Zheng D., Li J. Mechanism of megaloblastic anemia combined with hemolysis. Bioengineered. 2021. 12(1):6703-6712. https://doi.org/10.1080/21655979.2021.1952366
Loyola-Leyva A., Loyola-Rodríguez J.P., Terán-Figueroa Y., Camacho-Lopez S., González F.J., Barquera S. Application of atomic force microscopy to assess erythrocytes morphology in early stages of diabetes. A pilot study. Micron. 2021. 141:102982. https://doi.org/10.1016/j.micron.2020.102982
Wang K., Li Z., Egini O., Wadgaonkar R., Jiang X.C., Chen Y. Atomic force microscopy reveals involvement of the cell envelope in biomechanical properties of sickle erythrocytes. BMC Biol. 2023. 21(1): 31. https://doi.org/10.1186/s12915-023-01523-3
Utkin D.V., Bulgakova E.G., Erokhin P.S., Kuznetsov O.S., Kuklev V.E., Osina N.A. Izvestiya SSU New series. Series Chemistry. Biology. Ecology, 2019. Vol. 19, 1. PP. 87-93.
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. Nanoindustry 2021. 14, 1 (103), PP. 62–67. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. FemtoScan Online software platform for biomedical applications and materials science. Medicine and High Technologies. 2018. 2. PP. 10–13.
Buryachkovskaya L.I., Melkumyants A.M., Lomakin N.V., Antonova O.A., Ermishkin V.V. Damage to the vascular endothelium and erythrocytes in patients with COVID-19. Consilium Medicum. 2021. 23 (6): PP. 469–476. https://doi.org/10.26442/20751753.2021.6.200939