rus
Issue #2/2019
A.V.Khokhlova, I.O.Zolotovskii, E.S.Pogodina, Y.V.Saenko, D.A.Stoliarov, S.N.Vorsina, S.G.Sokolovski, A.A.Fotiadi, D.A.Liamina, E.U.Rafailov
The influence of 1265 nm laser radiation on human adenocarcinoma cells
The influence of 1265 nm laser radiation on human adenocarcinoma cells
To date, the mechanism responsible for photobiomodulation oxidative stress induced by 1265 nm laser light is unclear, but mitochondria are considered the most probable acceptors of laser radiation at this wavelength. We studied oxidative stress, mitochondrial potential, the level of reduced glutathione, and the viability of human adenocarcinoma cells. Narrow-band and broad-band laser irradiation at the doses of 9.45 and 66.6-400 J/cm2, respectively, caused cell death, an increase of reactive oxygen species intracellular concentration and a disturbance of the mitochondrial functions. Thus, lasers at the wavelength of 1265 nm affect HCT116 cells through mitochondrial damage, and the dose increase contributes to cell damage without the heating effect.
Теги: 1265 nm laser radiation 1265 нм cancer cells mitochondria near-infrared lasers oxidative stress photobiomodulation therapy reactive oxygen species singlet oxygen активные формы кислорода ик-лазеры митохондрии окислительный стресс раковые клетки фотобиомодуляционная терапия
ВВЕДЕНИЕ
В последние десятилетия область биомедицинского применения лазеров значительно увеличилась и сместилась от хирургических инструментов [1] и физиотерапевтических методик [2, 3] в сторону лечения опухолевых заболеваний [4, 5] и манипуляций в клеточной и молекулярной медицине [6], требующих более глубокого понимания механизмов взаимодействия излучения с биологическими структурами и процессами. На сегодняшний день лазерная терапия широко используется в стоматологии [7, 8], фотодинамической терапии [9, 10], лечении кожных заболеваний и косметических недостатков [11, 12] с использованием фотосенсибилизаторов и без него. Известно, что различные диапазоны длин волн могут вызывать диаметрально противоположные клеточные эффекты – от повреждения [13, 14] до регенерации [15, 16], что имеет большие перспективы как для лечения, так и для реабилитации после него.
Одной из самых востребованных областей использования лазеров является фотобиомодуляционная терапия (ФБМТ), широко применяемая в современной медицине. Основной механизм действия фотобиомодуляции связан с воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на внутриклеточные процессы путем активации внутриклеточных сигнальных путей через взаимодействие на эндогенные фотосенсибилизаторы [21, 22, 23, 24], которые могут быть представлены эндогенными порфиринами с линиями поглощения 400–900 нм и 1000–1550 нм [25–27]. Стоит отметить, что большинство внутриклеточных эндогенных фотосенсибилизаторов локализованы в митохондриях, которые благодаря этому становятся основными акцепторами лазерного излучения [28, 29]. Кроме того, одним из диапазонов НИЛИ, индуцирующих внутриклеточный окислительный стресс, является диапазон длин волн 1264–1270 нм, являющийся линией поглощения молекулярного кислорода [17, 18, 19, 20, 30, 31, 32].
Можно предположить, что при наличии в клетке эндогенного фотосенсибилизатора, чувствительного к лазерному излучению 1264–1270 нм, местом его локализации будут митохондрии из-за их строения и функциональных особенностей. Также интересным представляется вопрос, насколько линейной будет зависимость внутриклеточных эффектов от поглощенной дозы лазерного излучения. В работе мы изучаем влияние лазерного излучения с длиной волны 1265 нм и плотностью энергии 9,45–400 Дж/см2 на динамику окислительного стресса и митохондриального потенциала, а также на уровень восстановленного глутатиона и выживаемость.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Параметры лазерного излучения. В качестве источника низкоинтенсивного лазерного излучения мы использовали полупроводниковый узкополосный (высококогерентный) лазер с шириной линии излучения ~ 0,001 нм (Yenista Optics, OSICS T100 Tunable Laser Module T100 1310) [14].
Для изучения воздействия более высоких доз лазерного облучения применяли волоконный лазер с шириной линии ~ 2 нм, позволяющий использовать максимальную плотность энергии 400 Дж/см2 без дополнительного эффекта нагревания объекта облучения [17].
Расчет дозы облучения. Поверхностная доза (плотность энергии), поглощенная биологической тканью (E, Дж/см2), рассчитывалась по формуле:
E = Pt/S, (1)
где P – средняя мощность лазерного источника (Вт), t – время экспозиции (с), S – площадь облучения (см2) [17].
Культура клеток и реактивы. Эксперименты выполнены на культуре клеток рака толстого кишечника (аденокарциномы) человека HCT116 (ACCT CCL-247TM), полученной из Американской коллекции типов клеточных культур (Манассас, Вайоминг, США). Клетки содержали в стандартных условиях, рекомендованных производителем.
Культуральную среду DMEM/F12 и эмбриональную сыворотку поставляли соответственно ООО "Панэко" (Россия) и РАА Laboratories (Австралия); прочие реактивы были получены от Sigma-Aldrich (США).
Облучение клеток. Клетки облучали в слайд-флаконах (SPL LifeSciences, Корея) при начальной плотности пассажа 105/мл в середине экспоненциальной фазы в настольной камере микроскопа (UNO, OkoLab). Поглощенную дозу рассчитывали относительно характеристик источника и времени облучения (5–30 мин).
Каждый эксперимент повторялся не менее трех раз. В качестве контроля использовали ячейки слайд-флакона, во время облучения закрытые металлической фольгой.
Флуоресцентная микроскопия. Клеточную выживаемость определяли через сутки после облучения при дозах 9,45–400 Дж/см2. Клетки окрашивали раствором йодистого пропидия, как было описано ранее [33].
Через 30 мин и 3 ч после облучения определяли внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода (АФК), митохондриальный потенциал и уровень восстановленного глутатиона, как описано в [17].
Скорректированную интегральную флуоресценцию клетки (СИФК) рассчитывали после обработки данных, полученных с помощью программы Image J [34]. Значения представляли как отношение СИФК в экспериментальных и опытных группах, а статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента для парных переменных (p<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ
А. Влияние лазерного излучения с длиной волны 1265 нм на жизнеспособность раковых клеток
Мы сравнили влияние лазера 1265 нм на жизнеспособность клеток HCT116 через 24 ч после облучения (дозы 9,45; 66,6; 200 и 400 Дж/см2). Доля погибших клеток возрастает при увеличении плотности энергии лазерного излучения (рис.1).
Б. Окислительный стресс после воздействия лазерного излучения с длиной волны 1265 нм
Для оценки динамики воздействия лазерного излучения на длине волны 1265 нм на возникновение окислительного стресса определяли внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода (АФК) через 30 мин и 3 ч после облучения (дозы 9,45 и 400 Дж/см2). Через 30 мин после облучения отмечается статистически достоверное увеличение концентрации АФК (рис.2). Через 3 ч эффект лазерного облучения при 400 Дж/см2 усиливается почти в 2,5 раза (отношение CTCF 1,45 и 3,5 для низкой и высокой дозы соответственно), в то время как воздействие лазерного излучения при 9,45 Дж/см2 на клетки HCT116 в экспериментальной группе снижается до значений в контрольной группе.
В. Изменения митохондриального потенциала после воздействия лазерного излучения с длиной волны 1265 нм
Митохондриальный потенциал определяли через 30 мин и 3 ч после воздействия лазерного излучения 1265 нм (дозы 9,45 и 400 Дж/см2). Через 30 мин после облучения при минимальной дозе отмечается снижение митохондриального потенциала в экспериментальной группе (рис.3), а под воздействием максимальной дозы лазерного излучения изменений не происходит.
Г. Влияние лазерного излучения с длиной волны 1265 нм на уровень восстановленного глутатиона
Уровень восстановленного глутатиона (GSH) оценивали через 30 мин и 3 ч после воздействия лазерного излучения (дозы 9,45 и 400 Дж/см2). Через 30 мин после облучения при дозе 9,45 Дж/см2 в клетках HCT116 не отмечается изменений GSH, однако через 3 ч наблюдается его повышение на 38% (рис.4). После облучения при дозе 400 Дж/см2 наблюдаются противоположные эффекты, и уровень GSH значительно снижается.
ОБСУЖДЕНИЕ
Нами были исследованы изменения жизненных параметров раковых клеток линии HCT116 в ответ на воздействие двух лазеров с длиной волны 1265 нм, обеспечивающих плотности энергии от 9,45 до 400 Дж/см2.
Через 24 ч после облучения при дозах 9,45, 66,6, 200, 400 Дж/см2 наблюдали дозозависимое увеличение относительного количества погибших клеток (рис.1), причем можно отметить, что этот процесс протекает нелинейно. Это можно объяснить как отличающимися механизмами, лежащими в основе воздействия низкомощного узкополосного (высококогерентного) лазера и относительно мощного лазера, так и специфической реакцией раковых клеток на используемые дозы. Так, в [35] было показано, что при более высокой дозе, поглощенной изучаемыми культурами клеток, наблюдалась активация апоптоза непосредственно активными формами кислорода, в то время как при более низкой дозе происходила активация каскада каспаз [35]. Ранее отмечалось, что для лазерных систем с отличающимися параметрами присутствуют различные типы и механизмы повреждения ДНК в клетке [36]. Более того, выяснилось, что полная энергия для индукции одного и того же процесса (например, фосфорилирование H2AX) варьируется между различными системами.
Изучение динамики окислительного стресса показало, что через 3 ч после лазерного облучения при дозе 9,45 Дж/см2 в клетках HCT116 концентрация АФК снизилась до контрольных значений (рис.2), при этом, несмотря на отсутствие достоверных отличий между опытом и контролем, в ответ на окислительный стресс в клетках индуцируются некоторые негативные процессы: значительная их гибель через 24 ч после облучения и снижение митохондриального потенциала почти сразу после воздействия, сохраняющегося через 3 ч (рис.3). В то же время на данный момент сложно объяснить нестандартные изменения уровня восстановленного глутатиона, косвенного показателя усиления окислительных реакций в митохондриях, при облучении низкоинтенсивным (высококогерентным) лазером (рис.4).
Через 30 мин после воздействия лазерное излучение при дозе 400 Дж/см2 не показывает каких-либо отличий от уровня АФК при 9,45 Дж/см2, но через 3 ч это значение значительно увеличивается. Одним из вероятных механизмов усиления окислительного стресса является эффект "АФК-индуцированного высвобождения АФК", который хорошо описан для митохондрий как основных поставщиков АФК внутри клетки [37]. Лазерное излучение при 400 Дж/см2 вызывает повреждения ядерной ДНК, в том числе в динамике [17], что не наблюдается при более низких дозах, указывая на роль этого механизма в более позднем окислительном стрессе. Кроме того, достоверно низкий уровень восстановленного глутатиона, не восстанавливающийся через 3 ч, косвенно указывает на нарушение функционирования митохондрий (рис.4) [38].
Стоит отметить, что в данном исследовании зарегистрировано отсутствие каких-либо эффектов широкополосного относительно мощного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм при дозе 400 Дж/см2 на митохондриальный потенциал раковых клеток (рис.3). В то же время в одной из наших предыдущих работ было показано, что этот тип лазерного излучения может увеличивать митохондриальный потенциал в нераковых клетках CHO-K [17]. Это может быть связано с ингибированием синтеза АТФ в раковых клетках вследствие активации гликолиза [39].
Ширина линий лазеров низкой и относительно высокой мощности соответственно равна ∆λl~0,001 нм и ∆λh~2 нм. Соотношение спектральных плотностей мощности для соответствующих источников лазерного излучения:
(2)
где Pλl – спектральная плотность мощности узкополосного источника (Вт), Pλh – спектральная плотность мощности широкополосного источника (Вт), El – поверхностная плотность энергии низкомощного лазерного излучения (Дж/см2), Eh – поверхностная плотность энергии относительно высокомощного лазерного излучения (Дж/см2), ∆λl – ширина линии низкомощного (высококогерентного) лазерного источника (нм), ∆λh – ширина линии относительно высокомощного лазерного источника (нм).
Таким образом, для настоящего исследования спектральная плотность мощности низкомощного лазера в максимуме выше, чем соответствующая величина относительно высокомощного лазера. Все это указывает на возможность формирования узкополосного резонанса, предположительно, на поверхности мембран митохондрий. Это предположение требует дальнейшего рассмотрения и проверки, но может пролить свет на некоторые эффекты воздействия лазерного излучения, не объясненные до настоящего времени, например, так называемый "светокислородный эффект" [40].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наше исследование продемонстрировало сравнительные эффекты воздействия узкополосного (высококогерентного) низкоинтенсивного полупроводникового лазера и широкополосного относительно высокоинтенсивного волоконного лазера при дозах 9,45 и 66,6–400 Дж/см2, соответственно. Результаты экспериментов показали, что оба источника лазерного излучения с длиной волны 1265 нм вызывают окислительный стресс, приводя к гибели раковых клеток, и могут нарушать функционирование митохондрий. Однако некоторые физические характеристики лазеров, такие как поверхностная плотность энергии, характеризующая дозу, поглощенную культурой клеток, и ширина линии излучения, могут быть важны для интерпретации полученных результатов и дальнейших исследований.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа А.В.Хохловой, И.О.Золотовского, Д.А.Столярова, А.А.Фотиади и Ю.В.Саенко была частично поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации по государственному заданию Правительства РФ № 3.3889.2017. Работа С.Г.Соколовского и Е.У.Рафаилова была частично поддержана Российским научным фондом в рамках гранта № 18-15-00172 и частично в рамках исследовательской и инновационной программы ЕС FET H2020 MESO-BRAIN, грант № 713140. Работа А.А. Фотиади была поддержана Leverhulme Trust (# VP2-2016-042, приглашенный профессор, Университет Астона, Бирмингем).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCE
1. Azadgoli B., Baker R.Y. Laser applications in surgery. Ann Transl Med. 2016 Dec; 4(23): 452. doi: 10.21037/atm.2016.11.51.
2. Awotidebe A.W., Inglis-Jassiem G., Young T. Low-level laser therapy and exercise for patients with shoulder disorders in physiotherapy practice (a systematic review protocol). Syst Re. V. 2015; 4: 60. doi: 10.1186/s13643-015-0050-2.
3. Amorim Ramos G., Gonзalves Arliani G., Costa Astur D., de Castro Pochini A., Ejnisman B., Cohen M. Rehabilitation of hamstring muscle injuries: a literature review. Rev Bras Ortop. 2017 Jan-Feb; 52(1): 11–16. doi: 10.1016/j.rboe.2016.12.002.
4. Ash C., Town G., Whittall R., Tooze L., Phillips J. Lasers and intense pulsed light (IPL) association with cancerous lesions. Lasers Med Sci. 2017; 32(8): 1927–1933. doi: 10.1007/s10103-017-2310-y
5. Błochowiak K., Andrysiak P., Sidorowicz K., Witmanowski H., Hędzelek W., Sokalski J. Selected applications of Er:YAG and CO2 lasers for treatment of benign neoplasms and tumorous lesions in the mouth. Postepy Dermatol Alergol. 2015 Oct; 32(5): 337–343. doi: 10.5114/pdia.2015.48053.
6. Schomaker M., Heinemann D., Kalies S., Willenbrock S., Wagner S., Nolte I., Ripken T., Murua Escobar H., Meyer H., Heisterkamp A. Characterization of nanoparticle mediated laser transfection by femtosecond laser pulses for applications in molecular medicine. J Nanobiotechnology. 2015; 13: 10. doi: 10.1186/s12951-014-0057-1.
7. Shajahan P.A., Ranjith Kumar P., Hariprasad A., Mathew J., Shaji A.P., Fazeel Ahammed M. Lasers: The Magic Wand in Esthetic Dentistry. J Int Oral Health. 2015 Jun; 7(6): 119–121. PMID: 26124614.
8. Nazemisalman B., Farsadeghi M., Sokhansanj M. Types of Lasers and Their Applications in Pediatric Dentistry. J Lasers Med Sci. 2015 Summer; 6(3): 96–101. doi: 10.15171/jlms.2015.01.
9. Kim M., Jung H.Y., Park H.J. Topical PDT in the Treatment of Benign Skin Diseases: Principles and New Applications. Int J Mol Sci. 2015 Oct; 16(10): 23259–23278. doi: 10.3390/ijms161023259.
10. Moghissi K., Dixon K., Gibbins S. A Surgical View of Photodynamic Therapy in Oncology: A Review. Surg J (N Y). 2015 Dec; 1(1): e1–e15. doi: 10.1055/s-0035-1565246.
11. Trivedi M.K., Yang F.C., Cho B.K. A review of laser and light therapy in melasma. Int J Womens Dermatol. 2017 Mar; 3(1): 11–20. doi: 10.1016/j.ijwd.2017.01.004.
12. Bristow I.R. The effectiveness of lasers in the treatment of onychomycosis: a systematic review. J Foot Ankle Res. 2014; 7: 34. doi: 10.1186/1757-1146-7-34.
13. Saquilabon Mae Cruz G., Kong X., Alcaraz Silva B., Khatibzadeh N., Thai R., Berns M.W., Yokomori K. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nucleic Acids Res. 2016 Feb 18; 44(3): e27. doi: 10.1093/nar/gkv976.
14. Khokhlova A., Zolotovskii I., Stoliarov D., Vorsina S., Liamina D., Pogodina E., Fotiadi A.A., Sokolovski S.G., Saenko Y., Rafailov E.U. The Photobiomodulation of Vital Parameters of the Cancer Cell Culture by Low Dose of Near-IR Laser Irradiation. IEEE JOURNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS, VOL. 25, NO. 1, JANUARY/FEBRUARY 2019. doi: 10.1109/JSTQE.2018.2854539.
15. Sriramoju V., Alfano R.R. In vivo studies of ultrafast near-infrared laser tissue bonding and wound healing. J Biomed Opt. 2015 Oct; 20(10): 108001. doi: 10.1117/1.JBO.20.10.108001.
16. Hellman A.N., Vahidi B., Joon Kim H., Mismar W., Steward O., Li Jeon N., Venugopalan V. Examination of Axonal Injury and Regeneration in Microfluidic Neuronal Culture Using Pulsed Laser Microbeam Dissection. Lab Chip. 2010 Aug 21; 10(16): 2083–2092. doi: 10.1039/b927153h.
17. Saenko Y.V., Glushchenko E.S., Zolotovskii I.O., Sholokhov E., Kurkov A. Mitochondrial dependent oxidative stress in cell culture induced by laser radiation at 1265 nm. Lasers Med. Sci., vol. 31, pp. 405–413, 2016.
18. Firat E.T., Dağ A., Gьnay A., Kaya B., Karadede M.İ., Kanay B.E., Ketani A., Evliyaoğlu O., Uysal E. The effects of low-level laser therapy on palatal mucoperiosteal wound healing and oxidative stress status in experimental diabetic rats. Photomed. Laser Surgery, vol. 31, no. 7, pp. 315–321, 2013.
19. Oliveira C.S., Turchiello R., Kowaltowski A.J., Indig G.L. and Baptista M.S. "Major determinants of photoinduced cell death: Subcellular localization versus photosensitization efficiency," Free Radic. Biol. Med., vol. 51, pp. 824–833, 2011.
20. Anquez F., El Yazidi-Belkoura I., Randoux S., Suret P., Courtade E. Cancerous cell death from sensitizer free photo activation of singlet oxygen. Photochem. Photobiol., vol. 88, pp. 167–174, 2012.
21. Huang Y.Y., Nagata K., Tedford C.E., McCarthy T., Hamblin M.R. Low-level laser therapy (LLLT) reduces oxidative stress in primary cortical neurons in vitro. J. Biophoton., vol. 6, pp. 829–838, 2013.
22. Chen A.C., Arany P.R., Huang Y.Y., Tomkinson E.M., Sharma S.K., Kharkwal G.B., Saleem T., Mooney D., Yull F.E., Blackwell T.S., Hamblin M.R. "Low-level laser therapy activates NF-kB via generation of reactive oxygen species in mouse embryonic fibroblasts," PLoS One, vol. 6, 2011, Art. no. e22453.
23. Chen C.H., Hung H.S., Hsu S.H. Low-energy laser irradiation increases endothelial cell proliferation, migration, and eNOS gene expression possibly via PI3K signal pathway. Lasers Surgery Med., vol. 40, pp. 46–54, 2008.
24. Magrini T.D., dos Santos N.V., Milazzotto M.P., Cerchiaro G., da Silva Martinho H. Low-level laser therapy on MCF-7 cells: A micro-Fourier transform infrared spectroscopy study. J. Biomed. Opt., vol. 17, 2012, Art. no. 101516.
25. Silva D.C., Czarnecki K., Ryan M.D. Visible and resonance Raman spectra of low valent iron porphyrins. Inorg Chim Acta 287 (1):21–26, 1999.
26. Schwaighofer A., Steininger C., Hildenbrandt D.M. Time-resolved surface-enhanced IR-absorption spectroscopy of direct electron transfer to cytochrome c oxidase from R. sphaeroides. Biophys J 105(12):2706–2713, 2013.
27. Ritter M., Anderka O., Ludwig B., Mдntele W., Hellwig P. Electrochemical and FTIR spectroscopic characterization of the cytochrome bc 1 complex from Paracoccus denitrificans: evidence for protonation reactions coupled to quinone binding. Biochemistry 42 (42):12391–12399, 2003.
28. Giuliani A., Lorenzini L., Gallamini M., Massella A., Giardino L., Calzа L. Low infra-red laser light irradiation on cultured neural cells: Effects on mitochondria and cell viability after oxidative stress. BMC Complement Alternative Med., vol. 9, pp. 1–8, 2009.
29. Karu T.I., Pyatibrat L.V., Kolyakov S.F., Afanasyeva N.I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: Reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. J. Photochem. Photobiol. B, vol. 81, pp. 98–106, 2005.
30. Carvalho Costa J.L., de Brito A.A., de Oliveira A.P., de Castro Faria Neto H.C., Pereira T.M., de Carvalho R.A., Anatriello E., Aimbire F. The chemokines secretion and the oxidative stress are targets of low-level laser therapy in allergic lung inflammation. J. Biophotonics, vol. 9, pp. 1208–1221, 2016.
31. Sokolovski S.G., Zolotovskaya S.A., Goltsov A., Pourreyron C., South A.P., Rafailov E.U. Infrared laser pulse triggers increased singlet oxygen production in tumor cells. Sci. Rep., vol. 3, 2013, Art. no. 3484.
32. Yusupov A.S., Yoncharov S.E., Zalevskii J.D., Paramonov V.M., and Kurkov A.S. Raman fiber laser for the drug-free photodynamic therapy. Laser Phys., vol. 20, pp. 357–359, 2010.
33. Koda S., Sugimoto K. Pressure effect on the absorption and photodissociation of O2 near the dissociation threshold. J. Photochem. Photobio. C, Photochem. Rev., vol. 4, pp. 215–226, 2003.
34. Gan Z., Audi S.H., Bongard R.D., Gauthier K.M., Merker M.P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Amer. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., vol. 300, L762–L772, 2011.
35. Wu S., Xing D., Wang F., Chen T., Chen W.R. Mechanistic study of apoptosis induced by high-fluence low-power laser irradiation using fluorescence imaging techniques. J Biomed Opt. 2007 Nov-Dec;12(6):064015.
36. Kong X., Mohanty S.K., Stephens J., Heale J.T., Gomez-Godinez V., Shi L.Z., Kim J., Yokomori K., Berns M.W. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2009 May; 37(9): e68. doi: 10.1093/nar/gkp 221.
37. Zorov D.B., Juhaszova M., Sollott S.J. Mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) and ROS-Induced ROS Release. Physiol Re. v. 2014. Jul; 94(3): 909–950. doi: 10.1152/physre. v. 00026. 2013.
38. Ribas V., Garcıa-Ruiz C., Fernбndez-Checa J.C. Glutathione and mitochondria. Frontiers Pharmacology, vol. 5, pp. 1–19, 2014.
39. Gatenby R.A., Gillies R.J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature Rev., Cancer, vol. 4, pp. 891–899, 2004.
40. Захаров С.Д., Иванов А.В., Вольф Е.Б., Данилов В.П., Мурина Т.М., Нгуен К.Т., Новиков Е.Г., Панасенко Н.А., Перов С.Н., Скопинов С.А., Тимофеев Ю.П. Структурные перестройки в водной фазе клеточных суспензий и белковых растворов при светокислородном эффекте. Квантовая электроника, 2003, т. 33, № 2, с. 149–162. doi.org/10.1070/QE2003v033n02ABEH002376.
В последние десятилетия область биомедицинского применения лазеров значительно увеличилась и сместилась от хирургических инструментов [1] и физиотерапевтических методик [2, 3] в сторону лечения опухолевых заболеваний [4, 5] и манипуляций в клеточной и молекулярной медицине [6], требующих более глубокого понимания механизмов взаимодействия излучения с биологическими структурами и процессами. На сегодняшний день лазерная терапия широко используется в стоматологии [7, 8], фотодинамической терапии [9, 10], лечении кожных заболеваний и косметических недостатков [11, 12] с использованием фотосенсибилизаторов и без него. Известно, что различные диапазоны длин волн могут вызывать диаметрально противоположные клеточные эффекты – от повреждения [13, 14] до регенерации [15, 16], что имеет большие перспективы как для лечения, так и для реабилитации после него.
Одной из самых востребованных областей использования лазеров является фотобиомодуляционная терапия (ФБМТ), широко применяемая в современной медицине. Основной механизм действия фотобиомодуляции связан с воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на внутриклеточные процессы путем активации внутриклеточных сигнальных путей через взаимодействие на эндогенные фотосенсибилизаторы [21, 22, 23, 24], которые могут быть представлены эндогенными порфиринами с линиями поглощения 400–900 нм и 1000–1550 нм [25–27]. Стоит отметить, что большинство внутриклеточных эндогенных фотосенсибилизаторов локализованы в митохондриях, которые благодаря этому становятся основными акцепторами лазерного излучения [28, 29]. Кроме того, одним из диапазонов НИЛИ, индуцирующих внутриклеточный окислительный стресс, является диапазон длин волн 1264–1270 нм, являющийся линией поглощения молекулярного кислорода [17, 18, 19, 20, 30, 31, 32].
Можно предположить, что при наличии в клетке эндогенного фотосенсибилизатора, чувствительного к лазерному излучению 1264–1270 нм, местом его локализации будут митохондрии из-за их строения и функциональных особенностей. Также интересным представляется вопрос, насколько линейной будет зависимость внутриклеточных эффектов от поглощенной дозы лазерного излучения. В работе мы изучаем влияние лазерного излучения с длиной волны 1265 нм и плотностью энергии 9,45–400 Дж/см2 на динамику окислительного стресса и митохондриального потенциала, а также на уровень восстановленного глутатиона и выживаемость.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Параметры лазерного излучения. В качестве источника низкоинтенсивного лазерного излучения мы использовали полупроводниковый узкополосный (высококогерентный) лазер с шириной линии излучения ~ 0,001 нм (Yenista Optics, OSICS T100 Tunable Laser Module T100 1310) [14].
Для изучения воздействия более высоких доз лазерного облучения применяли волоконный лазер с шириной линии ~ 2 нм, позволяющий использовать максимальную плотность энергии 400 Дж/см2 без дополнительного эффекта нагревания объекта облучения [17].
Расчет дозы облучения. Поверхностная доза (плотность энергии), поглощенная биологической тканью (E, Дж/см2), рассчитывалась по формуле:
E = Pt/S, (1)
где P – средняя мощность лазерного источника (Вт), t – время экспозиции (с), S – площадь облучения (см2) [17].
Культура клеток и реактивы. Эксперименты выполнены на культуре клеток рака толстого кишечника (аденокарциномы) человека HCT116 (ACCT CCL-247TM), полученной из Американской коллекции типов клеточных культур (Манассас, Вайоминг, США). Клетки содержали в стандартных условиях, рекомендованных производителем.
Культуральную среду DMEM/F12 и эмбриональную сыворотку поставляли соответственно ООО "Панэко" (Россия) и РАА Laboratories (Австралия); прочие реактивы были получены от Sigma-Aldrich (США).
Облучение клеток. Клетки облучали в слайд-флаконах (SPL LifeSciences, Корея) при начальной плотности пассажа 105/мл в середине экспоненциальной фазы в настольной камере микроскопа (UNO, OkoLab). Поглощенную дозу рассчитывали относительно характеристик источника и времени облучения (5–30 мин).
Каждый эксперимент повторялся не менее трех раз. В качестве контроля использовали ячейки слайд-флакона, во время облучения закрытые металлической фольгой.
Флуоресцентная микроскопия. Клеточную выживаемость определяли через сутки после облучения при дозах 9,45–400 Дж/см2. Клетки окрашивали раствором йодистого пропидия, как было описано ранее [33].
Через 30 мин и 3 ч после облучения определяли внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода (АФК), митохондриальный потенциал и уровень восстановленного глутатиона, как описано в [17].
Скорректированную интегральную флуоресценцию клетки (СИФК) рассчитывали после обработки данных, полученных с помощью программы Image J [34]. Значения представляли как отношение СИФК в экспериментальных и опытных группах, а статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента для парных переменных (p<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ
А. Влияние лазерного излучения с длиной волны 1265 нм на жизнеспособность раковых клеток
Мы сравнили влияние лазера 1265 нм на жизнеспособность клеток HCT116 через 24 ч после облучения (дозы 9,45; 66,6; 200 и 400 Дж/см2). Доля погибших клеток возрастает при увеличении плотности энергии лазерного излучения (рис.1).
Б. Окислительный стресс после воздействия лазерного излучения с длиной волны 1265 нм
Для оценки динамики воздействия лазерного излучения на длине волны 1265 нм на возникновение окислительного стресса определяли внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода (АФК) через 30 мин и 3 ч после облучения (дозы 9,45 и 400 Дж/см2). Через 30 мин после облучения отмечается статистически достоверное увеличение концентрации АФК (рис.2). Через 3 ч эффект лазерного облучения при 400 Дж/см2 усиливается почти в 2,5 раза (отношение CTCF 1,45 и 3,5 для низкой и высокой дозы соответственно), в то время как воздействие лазерного излучения при 9,45 Дж/см2 на клетки HCT116 в экспериментальной группе снижается до значений в контрольной группе.
В. Изменения митохондриального потенциала после воздействия лазерного излучения с длиной волны 1265 нм
Митохондриальный потенциал определяли через 30 мин и 3 ч после воздействия лазерного излучения 1265 нм (дозы 9,45 и 400 Дж/см2). Через 30 мин после облучения при минимальной дозе отмечается снижение митохондриального потенциала в экспериментальной группе (рис.3), а под воздействием максимальной дозы лазерного излучения изменений не происходит.
Г. Влияние лазерного излучения с длиной волны 1265 нм на уровень восстановленного глутатиона
Уровень восстановленного глутатиона (GSH) оценивали через 30 мин и 3 ч после воздействия лазерного излучения (дозы 9,45 и 400 Дж/см2). Через 30 мин после облучения при дозе 9,45 Дж/см2 в клетках HCT116 не отмечается изменений GSH, однако через 3 ч наблюдается его повышение на 38% (рис.4). После облучения при дозе 400 Дж/см2 наблюдаются противоположные эффекты, и уровень GSH значительно снижается.
ОБСУЖДЕНИЕ
Нами были исследованы изменения жизненных параметров раковых клеток линии HCT116 в ответ на воздействие двух лазеров с длиной волны 1265 нм, обеспечивающих плотности энергии от 9,45 до 400 Дж/см2.
Через 24 ч после облучения при дозах 9,45, 66,6, 200, 400 Дж/см2 наблюдали дозозависимое увеличение относительного количества погибших клеток (рис.1), причем можно отметить, что этот процесс протекает нелинейно. Это можно объяснить как отличающимися механизмами, лежащими в основе воздействия низкомощного узкополосного (высококогерентного) лазера и относительно мощного лазера, так и специфической реакцией раковых клеток на используемые дозы. Так, в [35] было показано, что при более высокой дозе, поглощенной изучаемыми культурами клеток, наблюдалась активация апоптоза непосредственно активными формами кислорода, в то время как при более низкой дозе происходила активация каскада каспаз [35]. Ранее отмечалось, что для лазерных систем с отличающимися параметрами присутствуют различные типы и механизмы повреждения ДНК в клетке [36]. Более того, выяснилось, что полная энергия для индукции одного и того же процесса (например, фосфорилирование H2AX) варьируется между различными системами.
Изучение динамики окислительного стресса показало, что через 3 ч после лазерного облучения при дозе 9,45 Дж/см2 в клетках HCT116 концентрация АФК снизилась до контрольных значений (рис.2), при этом, несмотря на отсутствие достоверных отличий между опытом и контролем, в ответ на окислительный стресс в клетках индуцируются некоторые негативные процессы: значительная их гибель через 24 ч после облучения и снижение митохондриального потенциала почти сразу после воздействия, сохраняющегося через 3 ч (рис.3). В то же время на данный момент сложно объяснить нестандартные изменения уровня восстановленного глутатиона, косвенного показателя усиления окислительных реакций в митохондриях, при облучении низкоинтенсивным (высококогерентным) лазером (рис.4).
Через 30 мин после воздействия лазерное излучение при дозе 400 Дж/см2 не показывает каких-либо отличий от уровня АФК при 9,45 Дж/см2, но через 3 ч это значение значительно увеличивается. Одним из вероятных механизмов усиления окислительного стресса является эффект "АФК-индуцированного высвобождения АФК", который хорошо описан для митохондрий как основных поставщиков АФК внутри клетки [37]. Лазерное излучение при 400 Дж/см2 вызывает повреждения ядерной ДНК, в том числе в динамике [17], что не наблюдается при более низких дозах, указывая на роль этого механизма в более позднем окислительном стрессе. Кроме того, достоверно низкий уровень восстановленного глутатиона, не восстанавливающийся через 3 ч, косвенно указывает на нарушение функционирования митохондрий (рис.4) [38].
Стоит отметить, что в данном исследовании зарегистрировано отсутствие каких-либо эффектов широкополосного относительно мощного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм при дозе 400 Дж/см2 на митохондриальный потенциал раковых клеток (рис.3). В то же время в одной из наших предыдущих работ было показано, что этот тип лазерного излучения может увеличивать митохондриальный потенциал в нераковых клетках CHO-K [17]. Это может быть связано с ингибированием синтеза АТФ в раковых клетках вследствие активации гликолиза [39].
Ширина линий лазеров низкой и относительно высокой мощности соответственно равна ∆λl~0,001 нм и ∆λh~2 нм. Соотношение спектральных плотностей мощности для соответствующих источников лазерного излучения:
(2)
где Pλl – спектральная плотность мощности узкополосного источника (Вт), Pλh – спектральная плотность мощности широкополосного источника (Вт), El – поверхностная плотность энергии низкомощного лазерного излучения (Дж/см2), Eh – поверхностная плотность энергии относительно высокомощного лазерного излучения (Дж/см2), ∆λl – ширина линии низкомощного (высококогерентного) лазерного источника (нм), ∆λh – ширина линии относительно высокомощного лазерного источника (нм).
Таким образом, для настоящего исследования спектральная плотность мощности низкомощного лазера в максимуме выше, чем соответствующая величина относительно высокомощного лазера. Все это указывает на возможность формирования узкополосного резонанса, предположительно, на поверхности мембран митохондрий. Это предположение требует дальнейшего рассмотрения и проверки, но может пролить свет на некоторые эффекты воздействия лазерного излучения, не объясненные до настоящего времени, например, так называемый "светокислородный эффект" [40].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наше исследование продемонстрировало сравнительные эффекты воздействия узкополосного (высококогерентного) низкоинтенсивного полупроводникового лазера и широкополосного относительно высокоинтенсивного волоконного лазера при дозах 9,45 и 66,6–400 Дж/см2, соответственно. Результаты экспериментов показали, что оба источника лазерного излучения с длиной волны 1265 нм вызывают окислительный стресс, приводя к гибели раковых клеток, и могут нарушать функционирование митохондрий. Однако некоторые физические характеристики лазеров, такие как поверхностная плотность энергии, характеризующая дозу, поглощенную культурой клеток, и ширина линии излучения, могут быть важны для интерпретации полученных результатов и дальнейших исследований.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа А.В.Хохловой, И.О.Золотовского, Д.А.Столярова, А.А.Фотиади и Ю.В.Саенко была частично поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации по государственному заданию Правительства РФ № 3.3889.2017. Работа С.Г.Соколовского и Е.У.Рафаилова была частично поддержана Российским научным фондом в рамках гранта № 18-15-00172 и частично в рамках исследовательской и инновационной программы ЕС FET H2020 MESO-BRAIN, грант № 713140. Работа А.А. Фотиади была поддержана Leverhulme Trust (# VP2-2016-042, приглашенный профессор, Университет Астона, Бирмингем).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCE
1. Azadgoli B., Baker R.Y. Laser applications in surgery. Ann Transl Med. 2016 Dec; 4(23): 452. doi: 10.21037/atm.2016.11.51.
2. Awotidebe A.W., Inglis-Jassiem G., Young T. Low-level laser therapy and exercise for patients with shoulder disorders in physiotherapy practice (a systematic review protocol). Syst Re. V. 2015; 4: 60. doi: 10.1186/s13643-015-0050-2.
3. Amorim Ramos G., Gonзalves Arliani G., Costa Astur D., de Castro Pochini A., Ejnisman B., Cohen M. Rehabilitation of hamstring muscle injuries: a literature review. Rev Bras Ortop. 2017 Jan-Feb; 52(1): 11–16. doi: 10.1016/j.rboe.2016.12.002.
4. Ash C., Town G., Whittall R., Tooze L., Phillips J. Lasers and intense pulsed light (IPL) association with cancerous lesions. Lasers Med Sci. 2017; 32(8): 1927–1933. doi: 10.1007/s10103-017-2310-y
5. Błochowiak K., Andrysiak P., Sidorowicz K., Witmanowski H., Hędzelek W., Sokalski J. Selected applications of Er:YAG and CO2 lasers for treatment of benign neoplasms and tumorous lesions in the mouth. Postepy Dermatol Alergol. 2015 Oct; 32(5): 337–343. doi: 10.5114/pdia.2015.48053.
6. Schomaker M., Heinemann D., Kalies S., Willenbrock S., Wagner S., Nolte I., Ripken T., Murua Escobar H., Meyer H., Heisterkamp A. Characterization of nanoparticle mediated laser transfection by femtosecond laser pulses for applications in molecular medicine. J Nanobiotechnology. 2015; 13: 10. doi: 10.1186/s12951-014-0057-1.
7. Shajahan P.A., Ranjith Kumar P., Hariprasad A., Mathew J., Shaji A.P., Fazeel Ahammed M. Lasers: The Magic Wand in Esthetic Dentistry. J Int Oral Health. 2015 Jun; 7(6): 119–121. PMID: 26124614.
8. Nazemisalman B., Farsadeghi M., Sokhansanj M. Types of Lasers and Their Applications in Pediatric Dentistry. J Lasers Med Sci. 2015 Summer; 6(3): 96–101. doi: 10.15171/jlms.2015.01.
9. Kim M., Jung H.Y., Park H.J. Topical PDT in the Treatment of Benign Skin Diseases: Principles and New Applications. Int J Mol Sci. 2015 Oct; 16(10): 23259–23278. doi: 10.3390/ijms161023259.
10. Moghissi K., Dixon K., Gibbins S. A Surgical View of Photodynamic Therapy in Oncology: A Review. Surg J (N Y). 2015 Dec; 1(1): e1–e15. doi: 10.1055/s-0035-1565246.
11. Trivedi M.K., Yang F.C., Cho B.K. A review of laser and light therapy in melasma. Int J Womens Dermatol. 2017 Mar; 3(1): 11–20. doi: 10.1016/j.ijwd.2017.01.004.
12. Bristow I.R. The effectiveness of lasers in the treatment of onychomycosis: a systematic review. J Foot Ankle Res. 2014; 7: 34. doi: 10.1186/1757-1146-7-34.
13. Saquilabon Mae Cruz G., Kong X., Alcaraz Silva B., Khatibzadeh N., Thai R., Berns M.W., Yokomori K. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nucleic Acids Res. 2016 Feb 18; 44(3): e27. doi: 10.1093/nar/gkv976.
14. Khokhlova A., Zolotovskii I., Stoliarov D., Vorsina S., Liamina D., Pogodina E., Fotiadi A.A., Sokolovski S.G., Saenko Y., Rafailov E.U. The Photobiomodulation of Vital Parameters of the Cancer Cell Culture by Low Dose of Near-IR Laser Irradiation. IEEE JOURNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS, VOL. 25, NO. 1, JANUARY/FEBRUARY 2019. doi: 10.1109/JSTQE.2018.2854539.
15. Sriramoju V., Alfano R.R. In vivo studies of ultrafast near-infrared laser tissue bonding and wound healing. J Biomed Opt. 2015 Oct; 20(10): 108001. doi: 10.1117/1.JBO.20.10.108001.
16. Hellman A.N., Vahidi B., Joon Kim H., Mismar W., Steward O., Li Jeon N., Venugopalan V. Examination of Axonal Injury and Regeneration in Microfluidic Neuronal Culture Using Pulsed Laser Microbeam Dissection. Lab Chip. 2010 Aug 21; 10(16): 2083–2092. doi: 10.1039/b927153h.
17. Saenko Y.V., Glushchenko E.S., Zolotovskii I.O., Sholokhov E., Kurkov A. Mitochondrial dependent oxidative stress in cell culture induced by laser radiation at 1265 nm. Lasers Med. Sci., vol. 31, pp. 405–413, 2016.
18. Firat E.T., Dağ A., Gьnay A., Kaya B., Karadede M.İ., Kanay B.E., Ketani A., Evliyaoğlu O., Uysal E. The effects of low-level laser therapy on palatal mucoperiosteal wound healing and oxidative stress status in experimental diabetic rats. Photomed. Laser Surgery, vol. 31, no. 7, pp. 315–321, 2013.
19. Oliveira C.S., Turchiello R., Kowaltowski A.J., Indig G.L. and Baptista M.S. "Major determinants of photoinduced cell death: Subcellular localization versus photosensitization efficiency," Free Radic. Biol. Med., vol. 51, pp. 824–833, 2011.
20. Anquez F., El Yazidi-Belkoura I., Randoux S., Suret P., Courtade E. Cancerous cell death from sensitizer free photo activation of singlet oxygen. Photochem. Photobiol., vol. 88, pp. 167–174, 2012.
21. Huang Y.Y., Nagata K., Tedford C.E., McCarthy T., Hamblin M.R. Low-level laser therapy (LLLT) reduces oxidative stress in primary cortical neurons in vitro. J. Biophoton., vol. 6, pp. 829–838, 2013.
22. Chen A.C., Arany P.R., Huang Y.Y., Tomkinson E.M., Sharma S.K., Kharkwal G.B., Saleem T., Mooney D., Yull F.E., Blackwell T.S., Hamblin M.R. "Low-level laser therapy activates NF-kB via generation of reactive oxygen species in mouse embryonic fibroblasts," PLoS One, vol. 6, 2011, Art. no. e22453.
23. Chen C.H., Hung H.S., Hsu S.H. Low-energy laser irradiation increases endothelial cell proliferation, migration, and eNOS gene expression possibly via PI3K signal pathway. Lasers Surgery Med., vol. 40, pp. 46–54, 2008.
24. Magrini T.D., dos Santos N.V., Milazzotto M.P., Cerchiaro G., da Silva Martinho H. Low-level laser therapy on MCF-7 cells: A micro-Fourier transform infrared spectroscopy study. J. Biomed. Opt., vol. 17, 2012, Art. no. 101516.
25. Silva D.C., Czarnecki K., Ryan M.D. Visible and resonance Raman spectra of low valent iron porphyrins. Inorg Chim Acta 287 (1):21–26, 1999.
26. Schwaighofer A., Steininger C., Hildenbrandt D.M. Time-resolved surface-enhanced IR-absorption spectroscopy of direct electron transfer to cytochrome c oxidase from R. sphaeroides. Biophys J 105(12):2706–2713, 2013.
27. Ritter M., Anderka O., Ludwig B., Mдntele W., Hellwig P. Electrochemical and FTIR spectroscopic characterization of the cytochrome bc 1 complex from Paracoccus denitrificans: evidence for protonation reactions coupled to quinone binding. Biochemistry 42 (42):12391–12399, 2003.
28. Giuliani A., Lorenzini L., Gallamini M., Massella A., Giardino L., Calzа L. Low infra-red laser light irradiation on cultured neural cells: Effects on mitochondria and cell viability after oxidative stress. BMC Complement Alternative Med., vol. 9, pp. 1–8, 2009.
29. Karu T.I., Pyatibrat L.V., Kolyakov S.F., Afanasyeva N.I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: Reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. J. Photochem. Photobiol. B, vol. 81, pp. 98–106, 2005.
30. Carvalho Costa J.L., de Brito A.A., de Oliveira A.P., de Castro Faria Neto H.C., Pereira T.M., de Carvalho R.A., Anatriello E., Aimbire F. The chemokines secretion and the oxidative stress are targets of low-level laser therapy in allergic lung inflammation. J. Biophotonics, vol. 9, pp. 1208–1221, 2016.
31. Sokolovski S.G., Zolotovskaya S.A., Goltsov A., Pourreyron C., South A.P., Rafailov E.U. Infrared laser pulse triggers increased singlet oxygen production in tumor cells. Sci. Rep., vol. 3, 2013, Art. no. 3484.
32. Yusupov A.S., Yoncharov S.E., Zalevskii J.D., Paramonov V.M., and Kurkov A.S. Raman fiber laser for the drug-free photodynamic therapy. Laser Phys., vol. 20, pp. 357–359, 2010.
33. Koda S., Sugimoto K. Pressure effect on the absorption and photodissociation of O2 near the dissociation threshold. J. Photochem. Photobio. C, Photochem. Rev., vol. 4, pp. 215–226, 2003.
34. Gan Z., Audi S.H., Bongard R.D., Gauthier K.M., Merker M.P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Amer. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., vol. 300, L762–L772, 2011.
35. Wu S., Xing D., Wang F., Chen T., Chen W.R. Mechanistic study of apoptosis induced by high-fluence low-power laser irradiation using fluorescence imaging techniques. J Biomed Opt. 2007 Nov-Dec;12(6):064015.
36. Kong X., Mohanty S.K., Stephens J., Heale J.T., Gomez-Godinez V., Shi L.Z., Kim J., Yokomori K., Berns M.W. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2009 May; 37(9): e68. doi: 10.1093/nar/gkp 221.
37. Zorov D.B., Juhaszova M., Sollott S.J. Mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) and ROS-Induced ROS Release. Physiol Re. v. 2014. Jul; 94(3): 909–950. doi: 10.1152/physre. v. 00026. 2013.
38. Ribas V., Garcıa-Ruiz C., Fernбndez-Checa J.C. Glutathione and mitochondria. Frontiers Pharmacology, vol. 5, pp. 1–19, 2014.
39. Gatenby R.A., Gillies R.J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature Rev., Cancer, vol. 4, pp. 891–899, 2004.
40. Захаров С.Д., Иванов А.В., Вольф Е.Б., Данилов В.П., Мурина Т.М., Нгуен К.Т., Новиков Е.Г., Панасенко Н.А., Перов С.Н., Скопинов С.А., Тимофеев Ю.П. Структурные перестройки в водной фазе клеточных суспензий и белковых растворов при светокислородном эффекте. Квантовая электроника, 2003, т. 33, № 2, с. 149–162. doi.org/10.1070/QE2003v033n02ABEH002376.
Readers feedback
